支原體檢查培養(yǎng)基基本知識：
支原體(Mycoplasma)是細胞培養(yǎng)過程中常見的外源性污染物，開展支原體污染檢測是細胞質量控制微生物學安全性評價體系中的一項重要內容。由于活細胞制劑終產品不能滅菌處理，被支原體污染后不像細菌或者真菌那樣容易被肉眼看見，所以在其培養(yǎng)時也很難被觀察。因此需要適宜的支原體檢測方法。目前，《中華人民共和國藥典》規(guī)定的支原體檢測方法培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法 (DNA染色法)是檢測支原體的“金標準”，能夠檢測不同生長特性的支原體，具有廣譜性 。

環(huán)凱的精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基（貨號：MP01B/MP01BP）和精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基（貨號：MP01S/MP01SP）可用于檢驗利用精氨酸的支原體，如口腔支原體等，支原體肉湯培養(yǎng)基（貨號：MP02B/MP02BP）和支原體半流體培養(yǎng)基（貨號：MP02S/MP02SP）可用于檢驗利用葡萄糖的支原體，如肺炎支原體等。

支原體檢測培養(yǎng)基原理：

精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基：利用口腔支原體分解利用精氨酸產堿使得原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基：直接培養(yǎng)口腔支原體于營養(yǎng)物質充足的培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。支原體肉湯培養(yǎng)基：肺炎支原體通過葡萄糖代謝路徑利用葡萄糖產酸致使原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榈S色。支原體半流體培養(yǎng)基：直接培養(yǎng)肺炎支原體接種于營養(yǎng)物質充足的培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。

方法來源：

《中國藥典》2020年版 3301 支原體檢查法

靈敏度檢查（變色單位試驗法）

器具：

→試管：螺口旋蓋試管，利于培養(yǎng)時保持密閉；或者普通玻璃試管，滅菌時使用硅膠塞，培養(yǎng)時換成橡膠塞；或者培養(yǎng)時使用無菌液體石蠟液封。
→新生牛血清或者馬血清
→生物安全柜、生化培養(yǎng)箱等。
→培養(yǎng)基配制：
→基礎培養(yǎng)基：按標簽所示配制方法制備，分裝8 mL/支，121℃滅菌15 min，待用。
→完quan培養(yǎng)基：臨用前每支8 mL基礎培養(yǎng)基中加入2 mL新生牛血清或馬血清。

※ 半流體培養(yǎng)基在使用前應煮沸5~10 min，冷卻至55℃左右，然后加入新生牛血清或馬血清，充分搖勻。

→接種及培養(yǎng)：選取變色的新鮮培養(yǎng)物，接種至待檢培養(yǎng)基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至 10??~10??，接種在支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內；口腔支原體稀釋至 10?3~10??，接種在精氨酸支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內。每個稀釋度接種3 支試管，置36±1℃密閉培養(yǎng)7?14天，觀察培養(yǎng)基變色結果。

→結果判定：以接種后培養(yǎng)基管數的 2/3 以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度。

→陽性案例展示 

   圖A：精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)結果，左邊紅色為陽性右邊橙色為陰性；

   圖B：精氨酸支原體半流體培養(yǎng)結果，左邊有菌落懸浮為陽性，右邊試管為陰性；
   圖C：支原體肉湯培養(yǎng)結果，左邊黃色為陽性，右邊橙色為陰性；

   圖D：支原體半流體培養(yǎng)結果，左邊有菌落懸浮為陽性，右邊試管為陰性。

注意事項

→靈敏度測定時，支原體活化和傳代時建議做陰性對照，肉眼觀察到明顯的顏色變化時，需盡快進行傳代，過度培養(yǎng)會導致支原體的活性明顯衰減；

→半流體培養(yǎng)基煮沸融化時以全部溶解為宜，過度加熱易導致營養(yǎng)損失，接種時盡量在培養(yǎng)基未凝固，溫度約為37℃時接種支原體；

→支原體凍存可以使用10%甘油，凍干保護劑推薦選擇6%的蔗糖與1.5%的明膠。