多發(fā)性硬化癥(MS)是一種慢性免疫調(diào)節(jié)疾病，主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，導(dǎo)致世界各地年輕人的神經(jīng)殘疾。近年來，多發(fā)性硬化癥治療技術(shù)的進步和治療疾病藥物的增加為預(yù)防與該病相關(guān)的殘疾癥狀的復(fù)發(fā)提供了樂觀的前景。抑郁癥是多發(fā)性硬化癥患者的常見癥狀，在發(fā)病前后與運動癥狀同時出現(xiàn)。目前治療MS的方法并不能有效地同時解決身體殘疾和抑郁癥。羅氟司特是一種具有抗炎特性的磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑，已顯示出治療自身免疫性疾病的前景。

2024年4月1日，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)精神病學(xué)研究所附屬中大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科張志珺教授團隊在Journal of Affective Disorders上發(fā)表題為“Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor functionand depressive symptoms in multiple sclerosis”的研究論文，該研究表明羅氟司特可能成為改善MS抑郁癥狀和急性時相運動障礙的潛在藥物，其抗炎、減炎和抑制小膠質(zhì)細胞激活的特性提示其在MS治療中的潛力。IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁癥共有的關(guān)鍵基因，其編碼的細胞因子存在蛋白質(zhì)相互作用。IL-6可能在多發(fā)性硬化癥相關(guān)抑郁中發(fā)揮重要作用，IL-6拮抗劑可能成為改善多發(fā)性硬化癥抑郁的潛在治療策略。研究結(jié)果為進一步闡明MS和抑郁癥的發(fā)病機制提供了重要線索。

接下來，小愛具體介紹該研究團隊的實驗方法和主要研究結(jié)果。

一、實驗方法

研究人員采用實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠模型，研究羅氟司特的作用。評估運動功能障礙和抑郁癥狀，并進行組織病理學(xué)分析，評估其抗炎特性。流式細胞術(shù)檢測藥物對大腦小膠質(zhì)細胞的影響。用雙抗體夾心法檢測大鼠海馬區(qū)TNF-α，IL-1β和IL-6水平。

下面小愛主要介紹大鼠EAE模型的誘導(dǎo)方法

1、實驗動物

11周齡雌性SD大鼠（上海實驗動物中心提供），這些大鼠生活在受控的環(huán)境條件下（包括12h的明暗循環(huán)和20-22℃的室溫）。

2、EAE誘導(dǎo)

將等量新鮮勻漿的豚鼠脊髓與含10mg/mL卡介苗(BCG)的CFA用注射器在冰水混合物中大力混合，制成油包水乳劑。將上述乳劑按400μL總體積皮下注射于大鼠腿墊內(nèi)。陰性對照組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液與CFA混合的乳劑。分別于免疫后0h和48h腹腔注射0.1mL百日咳疫苗懸液（Absin，abs42024900）。

3、EAE癥狀評估

研究人員評估了從EAE誘導(dǎo)開始到安樂si為止的運動功能相關(guān)神經(jīng)行為缺陷。評分等級如下：

0級，無明顯運動障礙；1級，尾部癱瘓；2級，后腿癱瘓；3級，后腿癱瘓；4級，四肢癱瘓；5級，垂死或死亡。

二、研究結(jié)果

1、羅氟司特減輕EAE大鼠運動功能障礙和抑郁癥狀

研究人員分別從EAE誘導(dǎo)當(dāng)天開始注射0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg和2mg/kg的羅氟司特（標(biāo)記為試驗組Vehicle, Roflumilast(0.5)，Roflumilast(1)，和Roflumilast(2)組），直至動物安樂si(圖1A)。在EAE誘導(dǎo)第10天的大鼠中觀察到了疾病的連續(xù)發(fā)病。為了評估羅氟司特作為多發(fā)性硬化癥抑郁癥狀藥物治療的潛力，研究人員在運動功能障礙癥狀出現(xiàn)前對EAE大鼠進行了蔗糖偏好試驗(SPT)和強迫游泳試驗(FST)。結(jié)果表明，與陰性組相比，Vehicle組在蔗糖偏好方面有顯著下降；Roflumilast(2)組與Vehicle組相比，顯著升高(圖1B)。FST結(jié)果顯示，與陰性組相比，Vehicle組的不動時間顯著增加(圖1C)。然而，羅氟司特(2)組與Vehicle組相比，顯著縮短了不動時間。此外，Roflumilast(1)、Roflumilast(2)組平均每日神經(jīng)行為缺陷評分和累積神經(jīng)功能缺陷評分均明顯低于Vehicle組(圖1D和E)。

圖1 羅氟司特減輕EAE大鼠運動功能障礙和抑郁癥狀

2、羅氟司特減輕EAE大鼠脊髓組織病理學(xué)損傷

研究人員在術(shù)后第22天取大鼠脊髓組織石蠟切片，進行組織病理學(xué)分析。陰性組脊髓組織內(nèi)未見明顯的炎性細胞群，Vehicle組在脊髓實質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)出大量炎癥細胞簇。對HE染色切片進行半定量分析，結(jié)果顯示Vehicle組的組織病理學(xué)評分高于陰性組；Roflumilast(2)組的得分顯著低于Vehicle組(圖2A和B)。LFB和甘氨酸銀染色的組織學(xué)切片分析顯示了相同的病理變化。LFB染色分析顯示，與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組脊髓組織白質(zhì)區(qū)脫髓鞘百分比顯著降低(圖2A和C)。此外，甘氨酸銀染結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組脊髓組織白質(zhì)區(qū)軸突密度有統(tǒng)計學(xué)意義的增加(圖2A和D)。

圖2 羅氟司特減輕EAE大鼠脊髓組織病理學(xué)損傷

3、羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞的炎性增殖

Iba1和GFAP通常分別用作小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)記。研究人員對脊髓石蠟切片免疫組織化學(xué)染色顯示，EAE大鼠脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)均有Iba1⁺細胞聚集和GFAP⁺細胞的數(shù)量增加(圖3A)。統(tǒng)計分析表明，Roflumilast(1)和Roflumilast(2)組的Iba1+細胞數(shù)與Vehicle組相比顯著減少(圖3A和C)。盡管與Vehicle組相比，Roflumilast(1)和Roflumilast(2)組的GFAP⁺細胞數(shù)量都有所減少，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A和B)。

圖3 羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞炎性增殖

4、羅氟司特抑制M1小膠質(zhì)細胞表型并改善EAE運動功能

根據(jù)免疫功能，小膠質(zhì)細胞可分為M1型和M2型，其標(biāo)志物分別為iNOS和CD206。M2亞型抑制過度炎癥，而M1亞型以病理方式促進炎癥。研究人員利用免疫熒光技術(shù)觀察羅氟司特對EAE大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞表型的影響。與陰性組相比，EAE組iNOS⁺Iba1⁺細胞和CD206⁺Iba1⁺細胞顯著增加(圖4A-C)。與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組的iNOS⁺Iba1⁺細胞顯著減少(圖4A和B)。Roflumilast(2)組CD206⁺IBA1⁺細胞百分比有所下降，但無顯著差異(圖4A和C)。神經(jīng)行為缺陷評分與iNOS⁺Iba1⁺細胞百分率呈顯著正相關(guān)(圖4D)。然而，神經(jīng)行為缺陷評分與CD206⁺IBA1⁺細胞百分比的相關(guān)分析顯示無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4E)。

圖4 羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞M1表型轉(zhuǎn)化

5、羅氟司特對腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞免疫活性的影響

有文獻研究表明，大腦中的小膠質(zhì)細胞參與了抑郁癥的主要發(fā)病機制，因為它們在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常神經(jīng)元功能方面發(fā)揮了作用，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡、突觸形成、修剪和可塑性。為探討羅氟司特對大鼠腦組織小膠質(zhì)細胞活化的影響，研究人員采用流式細胞儀檢測CD45⁺CD11b⁺細胞CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表達水平。Vehicle組CD45⁺CD11b⁺細胞CD80、CD86、MHC-II和MHC-I的平均熒光強度與陰性組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B-E)。Roflumilast(2)組CD45+CD11b+細胞CD80、CD86和MHC-II的中位熒光強度與Vehicle組相比，顯著降低(圖5B、C和D)。然而，Roflumilast(2)和Vehicle組的MHC-I中值熒光強度之間沒有顯著差異(圖5E)。

圖5 羅氟司特對EAE大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化的影響

6、羅氟司特通過抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活減輕EAE抑郁癥狀

有文獻研究表明，海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活與抑郁癥密切相關(guān)。當(dāng)海馬區(qū)的小膠質(zhì)細胞過度激活時，它們會釋放促炎細胞因子，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和突觸喪失。小膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化可以對激活狀態(tài)和功能的改變做出反應(yīng)。因此，研究人員采用Sholl分析方法觀察羅氟司特對EAE大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞形態(tài)的影響。Sholl分析表明，Vehicle組的交叉點數(shù)量與陰性組相比，顯著減少，而Roflumilast(2)組的交叉點計數(shù)明顯高于Vehicle組(圖6A和B)。此外，Vehicle組的分支指數(shù)低于陰性組，Roflumilast(2)組的分支指數(shù)顯著高于Vehicle組(圖6C)。進一步的相關(guān)分析表明，蔗糖偏好與分枝指數(shù)呈顯著正相關(guān)(圖6D)，不動時間與分枝指數(shù)呈顯著負相關(guān)(圖6E)。

圖6 羅氟司特對海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的影響

7、海馬區(qū)IL-6表達減少與EAE誘導(dǎo)的抑郁癥的改善有關(guān)

研究人員使用STRING網(wǎng)站對與MS相關(guān)的主要19個基因進行的聚類分析表明，在最大的亞群中，IL6、IL1B和TNF表現(xiàn)出編碼蛋白的相互作用(圖7A)。通過GenDoma數(shù)據(jù)庫進行的進一步分析發(fā)現(xiàn)，IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁癥之間常見的疾病相關(guān)基因(圖7B)?？紤]到羅氟司特是PDE4的非特異性抑制劑，利用STRING網(wǎng)站對PDE4相關(guān)基因與上述三個候選基因之間的相互作用進行了額外的分析。結(jié)果表明，PDE4A與IL6、IL1B、TNF相互作用，PDE4B與IL1B、TNF相互作用，PDE4D可能通過PDE4A、PDE4B影響IL6、IL1B、TNF。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活與改善EAE的抑郁癥狀有關(guān)，因此研究人員進一步分析了海馬炎性因子濃度的差異。酶聯(lián)免疫吸附分析顯示，Roflumilast(2)組大鼠海馬區(qū)IL-1β、TNF-α和IL-6濃度低于Vehicle組(圖7D-E)。 Pearson's相關(guān)分析結(jié)果顯示，海馬區(qū)IL-1β和TNF-α的濃度與不動時間(圖7G-H)或?qū)φ崽堑钠珢?圖7J-K)之間沒有明顯的相關(guān)性。然而，海馬區(qū)IL-6濃度和不動時間之間發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)上顯著的正相關(guān)(圖7I)，而海馬區(qū)IL-6的濃度和蔗糖偏好之間觀察到了統(tǒng)計學(xué)上明顯的負相關(guān)(圖7L)。這些發(fā)現(xiàn)提示，海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞和IL-6可能在EAE相關(guān)性抑郁癥的病理生理過程中起重要作用。為了研究通過抑制IL-6信號通路直接抑制EAE大鼠的抑郁癥狀，研究人員用IL-6中和抗體治療EAE。研究結(jié)果顯示，羅氟司特對EAE大鼠的抑郁有類似的緩解作用(圖7M-O)。

圖7 海馬區(qū)IL-6表達減少與緩解EAE誘導(dǎo)的抑郁有關(guān)

8、羅氟司特抑制BV2細胞CD80、CD86、MHC-II的表達及IL-6的釋放

研究人員通過體外實驗觀察羅氟司特對小膠質(zhì)細胞免疫激活及IL-6表達的影響。結(jié)果表明，在有內(nèi)毒素刺激的情況下，羅氟司特抑制BV2細胞CD80、CD86和MHC-II的表達，并抑制IL-6的釋放(圖8A-D)。

圖8 羅氟司特抑制BV2細胞激活

通過以上的研究數(shù)據(jù)，該研究團隊得出結(jié)論：羅氟司特可能用于治療多發(fā)性硬化癥患者的抑郁和運動障礙，其抗炎、減炎和抑制小膠質(zhì)細胞活化的特性提示其治療多發(fā)性硬化癥的潛力。同時，研究者最后也提出該實驗的局限性：EAE模型的病理損害主要局限于脊髓組織，腦組織損害相對較輕，而MS損害可累及腦組織和脊髓組織。因此，動物實驗不能模擬人類多發(fā)性硬化癥的病理生理特征。此外，多發(fā)性硬化癥的臨床癥狀復(fù)雜多樣，包括感覺異常、共濟失調(diào)、疲勞和疼痛，這些癥狀在動物身上無法準(zhǔn)確量化。因此，還需要進一步的研究來評估多發(fā)性硬化癥患者的長期療效和安全性。

Wang Z, Zhang Y, Chai J, Wu Y, Zhang W, Zhang Z. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis[J]. J Affect Disord. 2024;350:761-773. doi:10.1016/j.jad.2023.12.074

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