iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術是由美國應用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標記技術。iTRAQ技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較最多10種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。

原理簡介

iTRAQ技術采用4種或8種同位素編碼的標簽，通過對氨基酸N端和賴氨酸殘基進行酶解后用iTRAQ試劑進行特異性標記，而后進行串聯質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量。

iTRAQ試劑包括3個部分：報告基團（Report group）、平衡基團（Balance group）和肽反應基團（Amine-specific reactive group）。報告基團相對分子質量為113-121Da（無120），因此iTRAQ試劑可同時標記8組樣品。平衡基團相對分子質量為192-184Da（無185），使得八種iTRAQ試劑分子量均為305Da，保證標記的同一肽段質荷比（m/z）相同。肽反應基團將iTRAQ試劑與肽段的N端及賴氨酸的氨基特異結合，在其上報告基團通過平衡基團與反應基團相連，形成等量異位標簽。

在串聯質譜中，來自不同樣品的同一肽段由于是等質量的，在一級質譜檢測（MS1）中表現為一個母離子峰（即同一個質譜峰），在二級質譜檢測（MS2）中進一步碎裂時，報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質量平衡基團丟失，報告基團則會產生相應的不同質量數的報告離子，它們各自質譜峰的信號強弱，代表著來源于不同樣品的該肽段及其所對應的蛋白的表達量的高低。因此，根據報告離子的信號強度值即可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。同時，多肽內的酰胺鍵斷裂，形成一系列b離子和y離子，得到離子片段的質量數，通過數據庫查詢和比較，可以鑒定出相應的蛋白質前體。

實驗流程

蛋白提取和質控——iTRAQ標記肽段——HPLC分級——質譜分析——數據庫處理——生物信息學分析

圖1 iTRAQ實驗流程圖。

TMT（Tandem Mass Tag）技術是由美國Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標記技術。與iTRAQ技術原理相同，優(yōu)勢類似，但是比iTRAQ擁有更多的標簽數，能一次上機更多樣品。

原理簡介

TMT技術采用2種、6種、10種或16種同位素標簽，特異性標記多肽的氨基基團，然后進行串聯質譜分析，監(jiān)測碎裂下來的標簽實現肽段定量。一次實驗可同時比較最多16組不同樣品中蛋白質的相對含量。

TMT標簽由三部分組成：分子量報告子（報告基團）、分子量標準化部分（平衡基團）和（肽）反應基團，形成2種、6種、10種或16種相對分子質量均為等量的異位標簽。TMT試劑通過反應基團與肽段上賴氨酸及N端氨基酸殘基相連，能夠高效地標記酶解后的肽段。在一級質譜中，分子量標準化部分使任何一種TMT試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在二級質譜中，釋放出分子量報告子。每個報告子都有各自du特的分子量，產生不同的報告離子峰，其強度反應了該肽段在不同樣品中的相對表達量信息，另外二級質譜中的肽段碎片離子峰質荷比反應了該肽段的序列信息，根據這些質譜原始數據可得到蛋白質的定性和相對定量信息。

實驗流程

蛋白提取和質控——TMT標記肽段——HPLC分級——質譜分析——數據庫處理——生物信息學分析

SILAC即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)。SILAC是一種通過使用13C-葡萄糖、15NH或3C標記氨基酸的培養(yǎng)基引入穩(wěn)定同位素，標記細胞或小生物體內的蛋白并根據質譜豐度比率進行定量的體內代謝標記技術。

最初SILAC使用的標記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的標記氨基酸有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。

原理簡介

在細胞培養(yǎng)基中加入天然同位素（輕型）或穩(wěn)定同位素（重型）標記的必需氨基酸，替代細胞培養(yǎng)基中相應的氨基酸，細胞經若干傳代后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸wan全摻入到細胞新合成的蛋白質中，取代了原有的氨基酸。這樣，兩個蛋白之間就存在分子量的改變，而其它化學性質無異。然后將兩組細胞混合，提取蛋白質，經分離純化后進行質譜測定。

每個肽段作為質譜中的一對：低分子量的肽段含有輕型氨基酸，來源于A組，高分子量的肽段則含有重型氨基酸，來源于B組。如果SILAC肽段對呈現1：1的比例，則蛋白質組中此蛋白的豐度無差異。如果含有重型氨基酸的肽段峰強度偏高，則說明B組中蛋白豐度更高。因為穩(wěn)定同位素標記的氨基酸與天然氨基酸的化學性質基本相同，除了分子量有差異。因此，質譜上峰強度的比值直接對應了A組與B組的比例，即可對蛋白質進行相對定量。

實驗流程

細胞培養(yǎng)標記——蛋白提純——1:1混合蛋白樣品——蛋白還原、酶切——LC-MS液質串聯檢測——生物信息學分析

圖2 SILAC實驗流程圖。

蛋白質非標記定量技術（Label-free）是經典的定量蛋白質組學技術。該技術無需昂貴的同位素（iTRAQ和TMT）標簽做內標，而是通過比較質譜分析次數或質譜峰強度，分析不同來源樣品蛋白的數量變化。該方法認為肽段在質譜中被捕獲檢測的頻率與其在混合物中的豐度成正相關，因此蛋白質被質譜檢測的計數反映了蛋白質的豐度，通過適當的數學公式可以將質譜檢測計數與蛋白質的量聯系起來，從而對蛋白質進行定量。

原理簡介

Label-free通過液質聯用技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，按照其原理主要分為兩種，di一種Spectrum counts類的非標記方法，發(fā)展比較早，已經形成多種定量算法。其主要的原理是以MS2的鑒定結果為定量基礎，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數據上的修正。第二種非標記定量的原理是以MS1為基礎，計算每個肽段的信號強度在LC-MS上的積分（如Maxquant），以積分面積對肽段對應的蛋白質進行相對定量。

實驗流程

蛋白提取——蛋白酶解——高效液相HPLC預分離——MS質譜分離——原始數據搜庫分析——生物信息學分析

圖3 Label-free實驗流程圖。

DIA（Data-independent acquisition）技術是瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Ruedi Aebersold博士及其團隊與AB-SCIEX公司聯合研發(fā)的一項全新質譜技術，而SWATH（Sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）便是基于DIA采集模式的一種新技術。

DIA采集模式將質譜整個全掃描范圍分為若干個小窗口，然后依次對每個窗口中的所有離子進行檢測、碎裂，使其能夠對掃描區(qū)間內的所有肽段離子進行高速一級MS掃描，再進行二級MS/MS分析，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息，在碎片離子層面完整重現nanoLC的色譜峰圖，因此DIA定量可以利用碎片離子隨時間的積分來表征肽段含量，而利用二級碎片離子定量不僅可以降低樣本檢測的缺失值，同時提高定量準確性和重復性，實現大樣本隊列中高覆蓋率，高穩(wěn)定，高精準的蛋白質組定量分析。但本質上，DIA也是一種Label-free定量方法。

原理簡介

DIA/SWATH技術將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內全部離子的所有碎片信息。以蛋白質組學樣品分析中常見的掃描范圍400~1200為例，每25 Dalton作為一個掃描間隔（SWATH），每個SWATH掃描時間設定為100 ms，那么該掃描范圍累計需要32個SWATH（1200-400/25=32），完成一次掃描僅需要3.2秒。

與傳統(tǒng)的shotgun技術相比，SWATH技術能夠將掃描區(qū)間內所有的肽段母離子經過超高速掃描并進行二級碎裂，使用二級碎片離子進行蛋白相對/jue對定量，從而獲得完整的肽段信息。

目前SWATH可以根據樣品TIC分布進行窗口優(yōu)化，從而獲取更多的譜圖信息，提高了精準度和分辨率。通過高分辨高靈敏質譜TripleTOF 5600/+以及zuixin的TripleTOF 6600進行分析掃描。因此，SWATH技術是一種真正全景式的、高通量的質譜技術，同時也解決了shotgun鑒定重復度較低的缺點。

實驗流程

蛋白提純——蛋白還原、酶切——HPLC分離肽段——LC-SWATH模式質譜檢測——OpenMS分析質譜數據——生物信息學分析

圖4 SWATH實驗流程圖。

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