磁珠法核酸提取過程中常見的誤區(qū)有哪些
使用生物磁珠提取核酸,在國內(nèi)還屬于較為新穎的核酸提取方式,相比于傳統(tǒng)的氯F異五醇抽提法和離心柱試劑盒法,這種方法還有很多人不慎了解,在使用磁珠法提純核酸的過程中,也存在著一些誤區(qū)。
誤區(qū)一:磁珠使用越多,提取效果越好
提取效果不佳時(shí),實(shí)驗(yàn)人員會(huì)考慮增加磁珠的用量,認(rèn)為磁珠多加一點(diǎn),可以吸附更多的核酸,但這種想法是不可取的。
磁珠的主要特點(diǎn)是既可以分散于液體中,也可以在外加磁場(chǎng)作用下使固液相分離,試劑體系,磁珠和液體的比例都應(yīng)該是有一定閾值的,超過一定的比例,過多的磁珠將因?yàn)闊o法均勻分散于液體中,而喪失其分散的特性,也使得洗滌過程中無法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率。而過量的磁珠也會(huì)吸附更多的雜質(zhì),對(duì)于除雜的效果影響非常大。甚至有些時(shí)候,過多的磁珠會(huì)吸附蛋白酶、溶菌酶等在液體體系中起主要作用的功能成分,導(dǎo)致整個(gè)試劑盒效率低下。有很多時(shí)候,在提取效果不佳的時(shí)候,減少磁珠使用量,反而是提升提取效果的好途徑。
誤區(qū)二:試劑使用的越多,提取效果越好
裂解效果不好?增加裂解液使用量。這是很多客戶在使用試劑盒中的慣性思維,但是對(duì)于磁珠法而言,每增加一部分液體體積,減少了更多的磁珠碰撞幾率,而降低磁珠碰撞幾率,會(huì)導(dǎo)致吸附率的大幅度下降。所以很多時(shí)候,雖然增加裂解液和洗滌液確實(shí)能夠起到增強(qiáng)裂解和增強(qiáng)洗滌的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,無法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的,所以單純?cè)黾釉噭┦褂昧扛纳铺崛⌒Ч⒉灰欢ㄓ行А?/span>
誤區(qū)三:洗滌次數(shù)越多,提取效果越好
提取得到的核酸雜質(zhì)過多時(shí),使用者會(huì)考慮多進(jìn)行幾次洗滌,以得到更為純凈的核酸。增加洗滌次數(shù)確實(shí)有利于提純核酸,但考慮到每次洗滌都會(huì)損失一定量的核酸,且增加了核酸斷裂的可能性,所以一般來說洗滌次數(shù)控制在2~4次為宜。
誤區(qū)四:樣本取用的越多,提取效果越好
在樣本不夠新鮮或者核酸含量本身很少的情況下,往往核酸提取效果不好,會(huì)采用多取樣本的方式增加核酸提取量。但簡(jiǎn)單地增加樣本取樣量,有時(shí)會(huì)引入過多的雜質(zhì),超出裂解液裂解能力,也會(huì)使提取效率降低,所以并不推薦通過簡(jiǎn)單的增加樣本取樣量的方式來達(dá)到增加提取量的目的。
如果確實(shí)是由于樣本量不足而引起的提取量過低,建議在前處理先經(jīng)過富集或者濃縮步驟再開始提取;或者增加裂解的性,使更多的核酸暴露出來也是一種解決方法。
誤區(qū)五:某一種磁珠好,應(yīng)該在所有實(shí)驗(yàn)中效果都好
磁珠的種類是多種多樣的,粒徑大小不同,分散性不同,磁響應(yīng)時(shí)間不同,包被基礎(chǔ)基質(zhì)不同,外層修飾官能團(tuán)不同,包被密度不同,官能團(tuán)臂長(zhǎng)不同,會(huì)導(dǎo)致磁珠特性千差萬別,所以不同磁珠所適應(yīng)的實(shí)驗(yàn)和體系也是不同的。像同樣是核酸提取的試劑,配方也并不相同,同樣應(yīng)用于核酸提取的磁珠,性質(zhì)也并非一致。
有的磁珠在常量核酸提取中表現(xiàn)出了更高的吸附效率,有的磁珠更適用于微量核酸提取,有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系,有的磁珠適合偏堿性系列的試劑體系,有的磁珠磁響應(yīng)性好但是沉降速度快,有的磁珠沉降速度慢但是磁響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。很少有一種磁珠能適用于所有實(shí)驗(yàn)的情況,除了固定的試劑盒配合,多數(shù)情況下,磁珠和試劑體系都要做一定時(shí)間的配合調(diào)整。
誤區(qū)六:和某種試劑盒對(duì)比效果不好,是磁珠不好
很多客戶在篩選磁珠過程中都是在已經(jīng)成熟試劑體系下,簡(jiǎn)單地等量替換磁珠,用于比較磁珠效果。這樣會(huì)很容易得出某種磁珠效果不好的結(jié)論,但實(shí)際上,由于不同磁珠適合的體系和用量是不同的,往往需要調(diào)整過后才能獲得更好的提取效果。
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