“值得信賴的流式伙伴”，是層浪生物一直致力追求的目標(biāo)。因此近期我們對(duì)層浪客戶的回訪做一個(gè)分析和總結(jié)，我們也期待您主動(dòng)反饋給我們您的使用評(píng)價(jià)。下面是來(lái)自國(guó)內(nèi)有名第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)采購(gòu)了層浪LongCyte^TM 流式細(xì)胞儀的使用反饋。

下面給大家介紹來(lái)自此用戶的項(xiàng)目——精子碎片化檢測(cè)

2023年，世界衛(wèi)生組織（WHO）的一份報(bào)告顯示，世界上約有17.5%的適齡生育夫婦受不孕和不育的困擾。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)不孕和不育率約為12%-18%，其中男方原因占40%-50%左右，精子原因居前位。精子DNA碎片（Sperm DNA fragmentation, SDF）在男性不孕癥中發(fā)生率較高，SDF常伴發(fā)少弱精子癥，也可發(fā)生于常規(guī)精液指標(biāo)正常的不育癥患者。其發(fā)生機(jī)制包括精子成熟障礙、凋亡異常和氧化應(yīng)激過(guò)高等。精子碎片化檢測(cè)是精子檢測(cè)中最重要的評(píng)估指標(biāo)之一。

精子SDF的檢測(cè)有很多方法，分為直接法和間接法，直接法有TUNEL、Coment、ISNT;間接法有SCSA、SCD、DBD-FISH。流式常用方法是SCSA（精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析）檢測(cè)，與其他檢測(cè)方法相比，流式細(xì)胞術(shù)可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)分析數(shù)千、數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，顯著提高了SDF試驗(yàn)的可靠性。在SCSA檢測(cè)中重要指標(biāo)是精子DNA完整性(DFI)，即精子DNA碎片率。DFI是指精子在形成過(guò)程中受到某些有害因素(如吸煙、高溫、藥物等)影響，發(fā)生DNA鏈斷裂的精子占全部精子的百分比，使精子DNA完整性被破壞而產(chǎn)生斷裂，DFI值越高則生育能力越低。

檢測(cè)原理：

SCSA 被認(rèn)為是檢測(cè)精子 DNA 損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。其原理是：受損的精子DNA 在酸的作用下變性形成單鏈，而正常精子DNA維持雙鏈結(jié)構(gòu)。吖啶橙( AO) 與雙鏈 DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。發(fā)綠色熒光表示精子DNA完整，發(fā)紅色熒光代表精子DNA呈碎片化。

樣本準(zhǔn)備（來(lái)自客戶）：

1. 樣本在室溫液化30-60min；

2. 將4℃保存試劑A液、B液、C1液和C2液取出，C2離心后，將C2全部轉(zhuǎn)移至C1內(nèi)配成染色液；

3. 檢測(cè)管內(nèi)加入精子樣本10μL,加入 A液90μL，充分吹打混勻；

4. 加入B液200μL，計(jì)時(shí)30s；

5. 30s后時(shí)加入染色液600μL；

6. 染色完成1min后上機(jī)檢測(cè)，建議檢測(cè)在染色后40min之內(nèi)完成。

（注：實(shí)驗(yàn)步驟不同試劑廠家有差異）

檢測(cè)報(bào)告：

圖1. 精子檢測(cè)報(bào)告（LongCyte^TM）

圖示：Plot1，前散FSC和側(cè)散SSC圈中主群；Plot2，去除碎片信號(hào)，圈精子細(xì)胞；Plot3，Green門為綠色熒光信號(hào)的精子細(xì)胞，Red門為已去除碎片的紅色熒光信號(hào)的精子細(xì)胞，即Red門為DNA碎片化的精子細(xì)胞，高綠色熒光信號(hào)群（HDS）為MFI高于正常精子的信號(hào)。（注：Red檢測(cè)通道ECD，620/30；Green檢測(cè)通道FITC，530/30）

臨床上除了精子碎片化檢測(cè)以外；精子相關(guān)其他檢測(cè)項(xiàng)目還有質(zhì)膜完整性檢測(cè)，線粒體膜染色、凋亡檢測(cè)、活性氧檢測(cè)、精子Ca2+ 水平檢測(cè)、白細(xì)胞檢測(cè)、頂體反應(yīng)等。層浪流式細(xì)胞儀助力更多精子檢測(cè)相關(guān)的研究和臨床項(xiàng)目。層浪期望與更多生殖機(jī)構(gòu)聯(lián)手助力生殖檢測(cè)發(fā)展。

參考資料：

[1] 倪吳花，AshokAgarwal，孫瑩璞等，精子DNA 碎片檢測(cè)的臨床專家共識(shí), 生殖醫(yī)學(xué)雜志2023年2月第32卷第2期, 1004-3845.2023.02.002

[2] 精子碎片實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與臨床應(yīng)用專家共識(shí)編寫組，精子碎片實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與臨床應(yīng)用專家共識(shí)———基于流式細(xì)胞精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，中華男科學(xué)雜志 2022 年 2 月 第 28 卷 第 2 期。

[3] Flow cytometry and microscopic acridine orange test: relationship with standard semen analysis [J]. Reproductive BioMedicine Online, 2004, 8(4): 398-407.