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CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)目前被廣泛應(yīng)用于在hPSCs（多能干細(xì)胞）的特定基因中產(chǎn)生突變，以此模擬體外遺傳疾病的細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染后的混合細(xì)胞群同時(shí)包含未編輯和各種編輯的細(xì)胞，需要通過手動(dòng)稀釋克隆進(jìn)行分離，這個(gè)過程既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且步驟繁瑣。
最近一篇文章[1]利用賽多利斯CellCelector Flex全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)在CRISPR / Cas9基因編輯后，從混合細(xì)胞群中高效識別單細(xì)胞，并從這些分離的單細(xì)胞中精確分離單細(xì)胞克隆。那么，這個(gè)設(shè)備有什么秘密呢？
秘密1 納米孔板：讓細(xì)胞住上單間
24孔板中的每一個(gè)大孔都具有數(shù)千個(gè)方形納米孔（體積約為4 nL的微結(jié)構(gòu)）。在這種設(shè)計(jì)下，納米孔的存在可以增加孔內(nèi)的細(xì)胞密度，同時(shí)確保單個(gè)細(xì)胞能通過納米孔壁有效地分離。這使得數(shù)幾千個(gè)細(xì)胞能夠在同一大孔中共培養(yǎng)，同時(shí)保持其單克隆性，并且擁有更快的增殖速度。每個(gè)大孔只需要接種約1000-3000個(gè)細(xì)胞，接種細(xì)胞按照泊松分布隨機(jī)分布在納米孔中，因此，至少約30%的納米孔會(huì)被單細(xì)胞占據(jù)，從而大大提高單細(xì)胞的分離效率。
圖1. CellCelector Flex全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)和24孔納米孔板：
A.每個(gè)納米孔形成一個(gè)正方形（200×200 μm），由100 μm高的壁界定；
B. 系統(tǒng)能自動(dòng)拼接整個(gè)孔圖像并自動(dòng)分割納米孔，在每個(gè)代表性孔中，軟件能通過分割識別2,263個(gè)方形納米孔，每個(gè)識別的納米孔都用紅線包圍，并分配一個(gè)唯一ID，以便在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)可追溯性；C. CellCelector Flex 概述：（a） 倒置熒光顯微鏡和電動(dòng)載物臺;（b）終板工作臺和（c）帶有高精度玻璃毛細(xì)管的單細(xì)胞挑取機(jī)械臂（放大視角見圖D.）；
E. 系統(tǒng)俯視圖：平臺由專用區(qū)域組成，（a）源板工作臺（b）滅菌罐和（c）廢物容器
秘密2自動(dòng)識別單克隆孔
為了驗(yàn)證該系統(tǒng)識別、篩選和挑取hPSC克隆方面的能力，文中生成了兩個(gè)具有整合GFP或mCherry基因的hPSC細(xì)胞系，并將轉(zhuǎn)基因插入到腺相關(guān)病毒整合位點(diǎn)1（AAVS1）位點(diǎn)。以等比例混合無標(biāo)記，分別表達(dá)GFP和mCherry的hPSC，然后將它們接種到納米孔中。在D0（第0天），使用CellCelector Flex系統(tǒng)自動(dòng)掃描接種了細(xì)胞的納米孔。然后使用CellCelector Flex軟件的特定圖像分析算法（包括設(shè)定單細(xì)胞大小和球形度等參數(shù)閾值）對D0的單細(xì)胞納米孔進(jìn)行鑒定。在挑選前的第3-5天，我們再次掃描納米孔板，系統(tǒng)會(huì)根據(jù)其生長自動(dòng)選擇單細(xì)胞來源的細(xì)胞克隆團(tuán)，并提供基于圖像的單克隆證明。文章使用CellCelector Flex玻璃毛細(xì)管挑頭對細(xì)胞克隆團(tuán)進(jìn)行挑取，并將其接種在96孔板中。在培養(yǎng)過程中，可以使用Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)跟蹤細(xì)胞的生長。
圖2. 單克隆細(xì)胞挑選示意圖
圖3.單克隆自動(dòng)識別示意圖：
左右圖分別展示了D0和D4的同一位置納米孔，只有當(dāng)D0是單克隆并且在D4有細(xì)胞增殖的納米孔才會(huì)被自動(dòng)識別和挑取
圖4. 自動(dòng)分離納米孔中的單細(xì)胞克隆：
A. 單細(xì)胞來源的hPSC克隆自動(dòng)分離的示意圖，在將單細(xì)胞接種到納米孔板和自動(dòng)克隆挑取之前，將混合的無標(biāo)記、mCherry 和 GFP 標(biāo)記的 hiPSC 群體 （1：1：1） 混合；
B. 無標(biāo)記hiPSC、GFP-hiPSC和mCherry-hiPSCs的代表性圖像，分別在第0天（D0） a）納米孔內(nèi)培養(yǎng)3天（D3）（b）以及由CellCelecto Flex的自動(dòng)機(jī)械臂挑取前（c）后（d）作為單細(xì)胞接種，選擇的細(xì)胞克隆團(tuán)在面板（c）和（d）中用虛線突出顯示，挑取后，將細(xì)胞克隆團(tuán)接種到96孔板中，然后在D5，D10和D18（e，f，g）處成像
秘密3 溫和挑取細(xì)胞，無交叉污染
文章中作者還探究了單細(xì)胞挑取過程中大家最為關(guān)心的交叉污染問題。由于玻璃毛細(xì)管在每次取樣之間不會(huì)更換，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)評估了使用同一毛細(xì)管連續(xù)取樣和接種細(xì)胞克隆團(tuán)是否會(huì)導(dǎo)致交叉污染。連續(xù)挑取無標(biāo)記、GFP 或 mCherry 熒光的細(xì)胞克隆團(tuán)并接種。細(xì)胞增殖后，在接種孔里沒有觀察到細(xì)胞克隆團(tuán)的熒光顏色混合。因此，連續(xù)提取不同的細(xì)胞克隆團(tuán)不會(huì)引起交叉污染。并且?guī)缀跛刑羧〗臃N后的培養(yǎng)孔里的細(xì)胞克隆團(tuán)都進(jìn)行了增殖，也說明挑取和接種不會(huì)影響細(xì)胞活性。
圖5. 對接種后的孔進(jìn)行成像結(jié)果
文章最后用免疫熒光觀測和測序驗(yàn)證了挑取后干細(xì)胞的多能性和基因整合度。
CellCelector與傳統(tǒng)挑取兩種方法的對比示意圖
傳統(tǒng)的手動(dòng)挑選和培養(yǎng)條件，不僅操作繁瑣，效率低下，而且容易造成污染。CellCelector系統(tǒng)的單細(xì)胞分離方案能夠?qū)r(shí)間從傳統(tǒng)方法的7-9天縮短到3-4天，在基因編輯后能夠可靠地分析單細(xì)胞克隆，減少人工操作，減少培養(yǎng)皿數(shù)量，縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高可溯源性，從而高效地生成遺傳病或研究基因功能的hPSC。
這樣的系統(tǒng)，做干細(xì)胞的你怎能不愛？
《基于圖像的全自動(dòng)干細(xì)胞克隆篩選及分離》
下載應(yīng)用手冊，了解如何使用CellCelector Flex全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)，對干細(xì)胞集落進(jìn)行高特異性、溫和的自動(dòng)化轉(zhuǎn)移。
-參考文獻(xiàn)-
[1] Frank E, et al. Semi-automated optimized method to isolate CRISPR/Cas9 edited human pluripotent stem cell clones. Stem Cell Res Ther. 2023 Apr 27;14(1):110. doi: 10.1186/s13287-023-03327-2.
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