操作流程：

1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜，第二天用自來水沖洗20遍，置于無水乙醇中6小時，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干，消毒，再烘干后放入超凈臺備用。

2.準(zhǔn)備好的蓋玻片或者專業(yè)的細(xì)胞爬片需要根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。

3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合，這樣才能避免長成雙層細(xì)胞。

4.常規(guī)免疫熒光操作后，取出爬片。準(zhǔn)備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進(jìn)行成像。

5.在激光共聚焦成像之前，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細(xì)胞狀態(tài)和成像效果，再去做激光共聚焦，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

圖2：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程，可以直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿）

操作流程：

1.在超凈臺中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿，取出培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中靜置，等待細(xì)胞貼壁。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長置合適密度再取出，進(jìn)行免疫熒光染色。

2.吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細(xì)胞。

3.20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100

4.10分鐘后，吸出Triton，清洗細(xì)胞后加入BSA封閉。

5.加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像。

使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋，可以減少揮發(fā)；如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿，有個巧妙的鎖扣設(shè)計(jì)，可以扣緊培養(yǎng)皿，確保在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會揮發(fā)(如圖3）。

圖3：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計(jì)