1.  引言

雖然 DLS 在制藥行業(yè)廣泛使用，但關(guān)于方法開發(fā)和驗(yàn)證主題的文章很少。提及 DLS 的藥典測(cè)試是 USP<729>脂質(zhì)注射乳劑中的球體大小分布。1 因此，本文提供了有關(guān)在制藥行業(yè)中使用 DLS 的一些見解。

2.  USP<729>

此標(biāo)準(zhǔn)要求使用 100、250 和 400 nm 三個(gè)尺寸規(guī)格的 PSL 標(biāo)準(zhǔn)粒子來驗(yàn)證 DLS 系統(tǒng)。本文作者不理解為什么選擇這些粒徑，尤其是合格/不合格的標(biāo)準(zhǔn)是 500 nm。

許多使用DLS 的專家認(rèn)為，僅以一種粒徑進(jìn)行測(cè)試應(yīng)該即可驗(yàn)證系統(tǒng)是否正常運(yùn)行。對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行3次測(cè)量，強(qiáng)度加權(quán)平均粒徑和標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)與預(yù)期值在可接受的誤差范圍內(nèi)一致。而可接受的度是根據(jù)“在可接受的誤差范圍內(nèi)”給出的。也許平均粒徑在 ±10% 的范圍內(nèi)是合理的。

系統(tǒng)適用性部分指出，如果 CV 不超過 10%，則分析標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的重現(xiàn)性符合標(biāo)準(zhǔn)。通過 USP<729>測(cè)試要求強(qiáng)度平均粒徑小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用戶手冊(cè)指出，良好的高斯結(jié)果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值<3 表示通過結(jié)果。

3.  質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)說明

因?yàn)閁SP<729>測(cè)試是使用 DLS 的藥典專著，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定值得考慮，但藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一定適合所有藥物。一種更常見的規(guī)范方法是定義強(qiáng)度平均值的值和范圍以及與分布寬度相關(guān)的一些計(jì)算。DLS 的 ISO 標(biāo)準(zhǔn)建議關(guān)注強(qiáng)度平均值和多分散性指數(shù)(PI)。²

作者看到的一些 DLS 規(guī)格包括 D10、D50 和 D90 的值。這些值可能來自制藥行業(yè)廣泛使用激光衍射進(jìn)行粒度分析。USP<429>測(cè)試光衍射測(cè)量粒徑3經(jīng)常使用 D10、D50 和 D90。設(shè)置質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的另一種方法是從USP<429>中借鑒重現(xiàn)性相關(guān)內(nèi)容， USP<429>中“重復(fù)”部分給出的基于體積分布的重現(xiàn)性范圍為：

● D50 = 10%

● D10, D90 = 15%

● 在 10 µm 以下，這些最大值可以加倍

遵循這些指南的內(nèi)容，DLS 規(guī)格（根據(jù)定義尺寸小于 10 µm）對(duì)于強(qiáng)度平均值可以是可重復(fù)的 ±20%，對(duì)于 PI 或其他計(jì)算結(jié)果指示分布寬度是可重復(fù)的 ±30%。對(duì)于某些藥品，這可能是一個(gè)可以接受的范圍，但要注意當(dāng)粒徑非常小時(shí)出現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)問題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯(cuò)。但對(duì)于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì)，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。

4.  分析方法開發(fā)

在開發(fā)方法之前，需要調(diào)查樣品制備問題。這可以從簡(jiǎn)單的（將樣品移入比色皿中）到復(fù)雜的（用表面活性劑和超聲波分散）。樣品制備的主題超出了本文檔的范圍，但已在之前的技術(shù)說明中討論過。4 使用 DLS 制備樣品進(jìn)行分析時(shí)需要考慮的一些建議包括：

—— 測(cè)試濃度的影響。測(cè)量、稀釋并再次測(cè)量。

—— 測(cè)試測(cè)量時(shí)間的影響。測(cè)量 3、5 和 10 分鐘。

—— 確保任何稀釋劑都經(jīng)過充分過濾。WFI 可能不夠干凈。

—— 確保使用樣品池都足夠干凈。

—— 是否應(yīng)使用過濾器去除樣品中的大顆粒？

—— 哪個(gè)樣品池合適。

—— 調(diào)查任何可能影響結(jié)果的儀器設(shè)置。

優(yōu)化樣品制備步驟和儀器設(shè)置后，就可進(jìn)行測(cè)試重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。調(diào)查分析時(shí)間的微小變化是否對(duì)結(jié)果有任何重大影響。如果該方法需要 5 分鐘的分析時(shí)間，則在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒時(shí)測(cè)試。檢查結(jié)果是否相同。

一旦方法得到優(yōu)化，下一步就是按照標(biāo)準(zhǔn) FDA 指南記錄該方法。5 目標(biāo)是足夠詳細(xì)地描述程序，以便其他操作員可以執(zhí)行相同的測(cè)試并生成相同的結(jié)果。列出了必須包含的基本信息：

—— 原理/范圍：分析測(cè)試/技術(shù)的基本原理。

—— 裝置/設(shè)備：儀器類型、激光、檢測(cè)器、檢測(cè)角度和樣品池類型。

—— 操作參數(shù)：溫度、粘度、分析時(shí)間和通道寬度。

—— 試劑/標(biāo)準(zhǔn)品：用于驗(yàn)證性能的聚苯乙希乳膠 (PSL)。PSS 建議使用 90 nm PSL（請(qǐng)參閱 Entegris 技術(shù)說明 - 系統(tǒng)驗(yàn)證）。

—— 標(biāo)準(zhǔn)控制溶液制備：稀釋劑，稀釋。⁶  

—— 程序：程序的逐步描述。將準(zhǔn)備好的樣品放入比色皿中，放入到系統(tǒng)中，定義參數(shù)并進(jìn)行測(cè)量。

—— 系統(tǒng)適用性：測(cè)試以確保系統(tǒng)在使用時(shí)能夠正常運(yùn)行。⁶

—— 計(jì)算：所有結(jié)果計(jì)算通常直接在DLS 系統(tǒng)操作系統(tǒng)軟件中進(jìn)行。⁸ 可以在電子表格中進(jìn)行額外的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

—— 數(shù)據(jù)報(bào)告：數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)、格式、有效數(shù)字的表示。Entegris 建議將結(jié)果重點(diǎn)放在光強(qiáng)強(qiáng)度加權(quán)平均直徑上。

5.  關(guān)于參考標(biāo)準(zhǔn)和材料的說明

如上所述，我們認(rèn)為單個(gè)粒徑的測(cè)試足以驗(yàn)證系統(tǒng)是否正常運(yùn)行。多家供應(yīng)商提供多種粒徑標(biāo)準(zhǔn)品，客戶可以選擇他們推薦使用的樣品。但Entegris對(duì)兩種 PSL 標(biāo)準(zhǔn)粒子擁有豐富經(jīng)驗(yàn)，這些也是我們通常建議客戶用來驗(yàn)證其 Nicomp6 的樣本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 標(biāo)稱 PSL 標(biāo)準(zhǔn)通常用于驗(yàn)證 Nicomp 性能。樣品的目錄號(hào)為 3090A，認(rèn)證值為 92 ± 3 nm。另一個(gè)經(jīng)常使用的樣品是 Thermo Fisher 目錄號(hào) 5009A，值為 90 nm。該樣品不可追溯到 NIST，但我們有足夠的經(jīng)驗(yàn)推薦使用該樣品，而且它比 3000 系列產(chǎn)品便宜。

注：DLS 是一種不需要校準(zhǔn)的第一原理技術(shù)。該系統(tǒng)使用一種或多種 PSL 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。如果系統(tǒng)未通過驗(yàn)證步驟，則無法進(jìn)行調(diào)整以使結(jié)果進(jìn)入預(yù)期范圍。驗(yàn)證結(jié)果失敗可能是由于系統(tǒng)工作不正常而需要維修，或者更常見的是標(biāo)準(zhǔn)粒子準(zhǔn)備不當(dāng)，應(yīng)在嘗試另一次測(cè)量之前重新準(zhǔn)備。

6.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation