TRAP染色試劑盒說明書

產(chǎn)品簡介：

雅吉生物的抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI為底物，細(xì)胞內(nèi)被酸性磷酸酶水解釋放出磷酸和萘酚，萘酚與重氮鹽偶聯(lián)生成有色產(chǎn)物，定位于細(xì)胞質(zhì)中，若細(xì)胞內(nèi)的ACP有抗酒石酸的活性，則呈陽性反應(yīng)。 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP/TRACP)主要存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞等部位的TRAP和存在于細(xì)胞白血病人脾臟TRAP均在細(xì)胞濾泡中，并不釋放入血液，血液中TRAP絕大部分來源于破骨細(xì)胞。因而測量血液中TRAP可以了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)。 抗酒石酸酸性磷酸酶為骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物, 測定TRACP有助于了解生理條件和各種病理條件下的骨代謝狀況。存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞和白血病人脾臟的抗酒石酸酸性磷酸酶均在細(xì)胞濾泡中，并不是釋放入血液。血液中的TRAP絕大多數(shù)來源于破骨細(xì)胞，因此可以通過測量血液中的TRAP了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)?！?

TRAP染色試劑盒說明書試劑盒組成：

自備材料：

光學(xué)顯微鏡、染缸、移液器、秒表、冰盒、純水、載玻片、吸頭、一次性手套

適用樣本

1. 石蠟切片

2. 冰凍切片

3. 細(xì)胞涂片，爬片

4.血涂片等

操作步驟(僅供參考)：

工作液的配制:

1．底物反應(yīng)液B的配制：使用前用移液器將試劑B2吸入試劑B1中，溶解混勻，配成甲液；將試劑B4吸入試劑B3中，溶解混勻，配成乙液。將甲液和乙液混勻即成底物反應(yīng)液B。

2．底物反應(yīng)液C的配制：使用前用移液器將試劑C2吸入試劑C1中，溶解混勻，即成底物反應(yīng)液C。

3．底物反應(yīng)液E的配制：使用前用移液器將試劑E2吸入試劑E1中，溶解混勻，即成底物反應(yīng)液E。

4．底物孵育液的配制：在染色缸中加入30ml蒸餾水，37℃水浴10分鐘。將底物反應(yīng)液B、C、D、E依次加入已預(yù)溫的蒸餾水中混合并充分混勻。

注意：所有的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，請使用前新鮮配制，配制后立即使用，一次使用完，不可放置。

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樣本的染色處理：

一、血涂片及骨髓涂片

1、推片：

取全血或骨髓3ul左右置載玻片上，將推玻片保持與載玻片30°角，置于血滴正前方，稍微往后移與血滴接觸，血滴沿推片下緣散開，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動，至血滴鋪完血膜為止。不要太薄，以免細(xì)胞太少，也不要太厚，以免太重疊。

2、固定：

讓涂片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。

3、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。

4、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

二、細(xì)胞涂片及細(xì)胞爬片

1、固定：

將細(xì)胞涂片或細(xì)胞爬片放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。

2、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。

3、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染?？捎锰K木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

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三、冰凍切片

1、回溫：

將保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫5-10分鐘?？梢苑旁?7℃孵箱中進(jìn)行回溫，或者將切片架放置在一個小盒子中，將盒子置于37℃水浴鍋中進(jìn)行回溫。

2、水合：

將回溫好的切片，水中浸泡1-2分鐘。

3、固定：

讓切片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。

4、孵育：

水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。

5、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染?？捎锰K木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

四、石蠟切片

1、脫蠟：

二甲苯中脫蠟5-10分鐘。再換用新鮮的二甲苯脫蠟5-10分鐘。

2、浸泡：

無水乙醇浸泡5分鐘。再分別用90%、70%乙醇各2分鐘。

3、水合：

蒸餾水中浸泡2分鐘。

4、孵育：

還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。

5、復(fù)染：

孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染?？捎锰K木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

結(jié)果分析：

陽性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒，定位于胞漿中。

常見問題：

1細(xì)胞誘導(dǎo)不成功？

細(xì)胞系或原代BMM細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時，細(xì)胞因子的質(zhì)量很重要。誘導(dǎo)效果不好時可以考慮調(diào)整誘導(dǎo)條件，提高RANKL濃度或者嘗試是否添加M-CSF。

2.如何判斷陽性細(xì)胞？

一般不通過形態(tài)變化說明，RAW細(xì)胞非常形態(tài)非常多樣，形態(tài)變化并不能說明問題。一般認(rèn)為多核加上TRAP陽性才能說是多核破骨細(xì)胞。

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注意事項：

1.TRAP孵育液易失效，本法宜用皮膚穿刺血涂片，晾干后應(yīng)及時染色；

2.對冰凍切片染色時，應(yīng)減少切片在室溫暴露的時間。

3.樣本需新鮮，取材后應(yīng)立即處理，否則會影響酶的活性。

4.組織固定需在4℃冰箱進(jìn)行，時間不宜超過24h，否則酶活性會減弱或消失。

5.一般不建議用石蠟切片。如果需要用石蠟切片，組織在石蠟包埋時，溫度不宜高于56℃。應(yīng)使用熔點為52～54℃的石蠟進(jìn)行浸蠟，浸蠟時間要短，否則酶活性會減弱或消失。

6.石蠟切片不需要固定。

有效期：2-8 ℃避光有效期為三個月

        注：拆封后請盡快使用，有效期為試劑盒未拆封并嚴(yán)格按要求條件保存的有效期。

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