激光共聚焦顯微鏡（K1-Fluo）是一種對(duì)樣品無(wú)損害的新型成像設(shè)備，在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，藥學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。激光共聚焦顯微鏡采用的是針孔成像的原理：在物鏡的焦平面位置設(shè)置一個(gè)帶有針孔的擋板，從而消除焦點(diǎn)以外的雜散光，從而消除了球差，并進(jìn)一步消除了色差，并且通過專屬的PZT 可以實(shí)現(xiàn)納米精度的軸向移動(dòng)，從而獲得更高精度的二維光學(xué)且切片，得到分辨率更高的三維圖像。

CLSM的主要優(yōu)點(diǎn)是：高清晰度，定位準(zhǔn)確，不會(huì)損傷樣品等。由于激光共聚焦顯微鏡采用的是無(wú)損檢測(cè)的方式，因此在進(jìn)行活細(xì)胞研究時(shí)，不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，能很好地在線樣品的真實(shí)圖像。目前，激光共聚焦顯微鏡主要應(yīng)用在藥劑學(xué)領(lǐng)域的藥物經(jīng)皮和粘膜吸收的研究，粘膜吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制的研究，藥物的細(xì)胞攝取，穿透性能及于細(xì)胞相互作用的機(jī)制研究和載藥微粒結(jié)構(gòu)觀察，藥物成型機(jī)制及釋藥機(jī)制等方面的研究。

1.1  在藥物劑型經(jīng)皮和粘膜吸收方面的應(yīng)用

激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用于脂質(zhì)體經(jīng)皮吸收研究

影響藥物皮膚吸收的因素很多，包括分子大小，組分的親酯性，處方組成，滲透促進(jìn)劑的使用及皮膚角質(zhì)層的物理狀態(tài)等。Verma等研究了兩種熒光標(biāo)記脂質(zhì)體的大小對(duì)皮膚吸收的影響，實(shí)驗(yàn)中將親水性熒光復(fù)合物羧基熒光素(CF)和親脂性熒光復(fù)合物1.1-雙十八烷基-3.33.3-四甲基靛炭-喹啉藍(lán)高氯酸鹽(DiI)包裹入脂質(zhì)體，應(yīng)用Franz擴(kuò)散池和標(biāo)準(zhǔn)皮膚洗提技術(shù)進(jìn)行人體腹部皮膚的體外滲透試驗(yàn)，以找到脂質(zhì)體局部用藥的最佳粒徑。通過CLSM觀察脂質(zhì)體滲透能力，發(fā)現(xiàn)Dil脂質(zhì)囊泡粒徑為71nm時(shí)在皮膚中熒光強(qiáng)度最大，CF脂質(zhì)體粒徑為120nm時(shí)能更好地促進(jìn)皮膚的滲透。Verma等在研究以脂質(zhì)體為載藥系統(tǒng)將藥物運(yùn)載至皮膚的機(jī)制中，將脂質(zhì)體用CF標(biāo)記后，用CLSM技術(shù)可得到CF經(jīng)過預(yù)定的時(shí)間到達(dá)表皮及皮膚深層的量。López-Pinto等也通過CLSM研究以米諾地爾為模型藥物制備的短鏈醇類的磷脂脂質(zhì)體及普通脂質(zhì)體的透皮效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)短鏈醇類的磷脂脂質(zhì)體的透皮數(shù)量及深度均高于普通脂質(zhì)體。CLSM不用對(duì)樣品進(jìn)行凍結(jié)固定就能直接觀察，且能穿透皮膚深層進(jìn)行觀察，所以被廣泛地應(yīng)用于親水和親脂標(biāo)記物在皮膚中的顯像及標(biāo)記物強(qiáng)度的分析中。

1.2 CLSM 在微粒粘膜吸收方面的應(yīng)用

近年米，膠體載藥系統(tǒng)由于能延長(zhǎng)藥物在血液中的循壞時(shí)間而備受關(guān)注。其中將藥物可降解的納米粒用聚乙二醇(PEG)包衣是一很有前景的載藥系統(tǒng)。與未包衣的聚乳酸(PLA)微粒相比，PEG長(zhǎng)循環(huán)微粒被單核巨噬細(xì)胞攝取的量有所降低。PEG長(zhǎng)循環(huán)納米粒不僅能延長(zhǎng)藥物循環(huán)時(shí)間，Tobio等發(fā)現(xiàn)它還能影響PLA納米粒與生物膜表面諸如鼻粘膜及腸粘膜的相互作用，是粘膜藥的良好載體系統(tǒng)。為研究PLA-PEG納米粒粒徑及PEG包衣密度對(duì)鼻粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，Vila等用不同分子量的PLA-PEG聚合物及不同的制備方法制備了不同粒徑、不同PEG包衣密度的PLA-PEG納米粒，將這些熒光標(biāo)記的微粒鼻腔給藥后，通過CLSM技術(shù)研究它們與小鼠鼻粘膜的相互作用及其轉(zhuǎn)運(yùn)過程。CLSM結(jié)果顯示PLA-PEG納米粒在鼻粘膜中的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高干PLA納米粒，表明PEG包衣對(duì)促進(jìn)鼻上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)有較大影響。同時(shí)小鼠鼻粘膜共聚焦圖像結(jié)果表明PLA-PEG粒子能穿透粘膜，其穿透能力不僅受粒子粒徑影響，也與PEG包衣密度有關(guān)。

CLSM在考察某種聚合物能否作為粘膜吸收的載體材料時(shí)也發(fā)揮了重要作用。Vila等通過CLSM考察了低分子量殼聚糖(CS)納米粒能否作為一種長(zhǎng)效鼻用疫苗的載體。他們將破傷風(fēng)毒素(TT)用離子交聯(lián)法包裹入低分子量CS納米粒中，異硫氰酸熒光素牛血清白蛋白(FITC-BSA)標(biāo)記后應(yīng)用CLSM觀察納米粒與小鼠鼻粘膜的相互作用。結(jié)果表明CS納米粒能穿透鼻上皮細(xì)胞，從而可以運(yùn)載抗原，說(shuō)明低分子量CS是一較有前景的鼻用疫苗運(yùn)輸載體。

1.3 CLSM 應(yīng)用于口服疫苗腸粘膜吸收的研究

口服疫苗在很多方面優(yōu)于注射劑，但疫苗在消化道易降解且較難進(jìn)入胃腸道的淋巴組織，限制了口服疫苗的發(fā)展。Lubben等用CLSM技術(shù)研究了殼聚糖微粒被鼠類腸道Pever's片段攝取的情況，CLSM結(jié)果顯示抗原卵白蛋白被包裹于殼聚糖微粒中，結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)證明了熒光標(biāo)記的殼聚糖微粒能被小鼠Pever's片段的上皮組織吸收。同時(shí)進(jìn)行的其它實(shí)驗(yàn)表明所制備的殼聚糖微粒的釋放行為適合用于口服，而Pever's片段的吸收是口服疫苗的關(guān)鍵過程，這些結(jié)果表明殼聚糖微粒是一很有前景的疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)載體。

2. CLSM 應(yīng)用于粘膜吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制的研究

對(duì)于甲基B一環(huán)糊精促進(jìn)鼻粘膜吸收的作用機(jī)制，有人認(rèn)為是通過打開鼻上皮組織緊密連接達(dá)到細(xì)胞增滲作用的。Marttin 等用透射電子顯微鏡研究了甲基B一環(huán)糊精對(duì)鼠鼻上皮組織緊密連接的影響，用CLSM研究了甲基B一環(huán)糊精對(duì)鼠上皮組織細(xì)胞骨架的影響，并將甲基B一環(huán)糊精的作用與吸收促進(jìn)劑牛磺二氫甾酸霉素鈉(STDHF)做比較。發(fā)現(xiàn)小鼠鼻腔給予2%田基B一環(huán)糊精后細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的分布與未處理的對(duì)照組相同，說(shuō)明甲基B一環(huán)糊精并不是通過對(duì)細(xì)胞骨架的作用以打開細(xì)胞的緊密連接。而注射1%STDHF的小鼠肌動(dòng)蛋白分布發(fā)生了改變，鼻上皮組織也被嚴(yán)重破壞，通過CLSM發(fā)現(xiàn)STDHF會(huì)使細(xì)胞腫脹及粘液外滲，說(shuō)明STDHF并不是暫時(shí)打開緊密連接，它損壞了上皮組織破壞了細(xì)胞緊密連接的完整性。因此Marttin等推斷甲基B一環(huán)糊精的促吸收機(jī)理是通過提高膜流動(dòng)性以打開細(xì)胞緊密連接的?？梢娡ㄟ^CLSM的直觀觀察有助于研究物質(zhì)的吸收機(jī)制，從而應(yīng)用到基礎(chǔ)理論的研究中。

3.CLSM 應(yīng)用于載藥微粒的結(jié)構(gòu)研究

觀察微球和微囊的常用方法有光學(xué)顯微鏡(LM)和掃描電子顯微鏡(SEM)，但LM易受光學(xué)焦平面以外的散色光的影響而降低成像質(zhì)量，對(duì)透光率差或不透光的材料制成的微球，只可觀察其形態(tài)和外部結(jié)構(gòu):SEM通常需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理且不能用干觀察物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所以需要尋找一種能用于觀察微粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的顯微技術(shù)。Lamprecht等在1999年探討了CLSM是否能作為觀察微囊結(jié)構(gòu)特征的新工具。他們應(yīng)用復(fù)凝聚法制備微球，然后將油相、明膠、阿拉伯膠分別進(jìn)行熒光標(biāo)記。通過CLSM首先成功定位了尼羅紅標(biāo)記的油相;其次，通過CLSM考察了異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的明膠及羅丹明B異硫氰酸(RBITC)標(biāo)記的阿拉伯膠兩種聚合物在囊壁材料中的分布。研究結(jié)果表明CLSM可用干評(píng)價(jià)和描述微球，觀察被包封相的分布，沉積和微球表面及內(nèi)部聚合物的結(jié)構(gòu)，它能提供微粒的三維視圖且具有很高的清晰度。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)也開始應(yīng)用CLSM技術(shù)分析載藥微球的結(jié)構(gòu)。譚豐蘋、陸彬等以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白藥物，以聚合物明膠與阿拉伯膠為成球材料制備了微球,應(yīng)用CLSM將微球在不同熒光通道下成像,并將微球切割成一系列平行切面并分別成像.對(duì)微球進(jìn)行三維重建和圖像分析。魏農(nóng)農(nóng)等利用雙重標(biāo)記法分別對(duì)殼聚糖和磷脂進(jìn)行標(biāo)記，用前體脂質(zhì)體方法制備氟尿嘧啶脂質(zhì)體，利用CLSM觀察殼聚糖包衣脂質(zhì)體的形態(tài),為進(jìn)一步研究該給藥系統(tǒng)提供依據(jù)。CLSM作為一種非破壞性觀察微粒的方法,可使焦平面以外的散射光減到lowest, 提高呈像質(zhì)量,并可通過使用不同的熒光標(biāo)記物識(shí)別幾種不同的化合物。若材料或藥物可被熒光標(biāo)記,用CLSM就可觀察微粒表面及內(nèi)部的結(jié)構(gòu):通過斷層掃描收集數(shù)個(gè)平行切面的數(shù)據(jù),使觀察樣品的三維圖像并分析成為可能。因此，采用CLSM對(duì)微粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究將具有很好的應(yīng)用前景。如Mladenovska等在研究5-氨基水楊酸殼聚糖_鈣-藻酸鹽微球的理化性質(zhì)中應(yīng)用CLSM分別觀察了殼聚糖及藻酸鹽在微球中的分布，結(jié)果顯示殼聚糖均勻分布于微球外部的囊殼中，而藻酸鹽則分布于微球的內(nèi)部，且由于異電性相吸在殼聚糖的邊緣分布較為集中，這證實(shí)了殼聚糖成功地包覆了5-氨基水楊酸微球，且聚合材料的理化性質(zhì)在制備微球的過程中并未發(fā)生變化，保持了原有的荷電性及表面活性。與普通的光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡相比，CLSM能提供微粒的更多信息，如微粒的三維結(jié)構(gòu)和囊壁聚合物的組成等，甚至能夠在不破壞微球的條件下測(cè)得其包封率，但對(duì)于形狀不規(guī)則及非球形的微粒還不適用。

4.CLSM 應(yīng)用于藥物成型機(jī)制和釋藥機(jī)制的研究

片劑是一傳統(tǒng)的、應(yīng)用廣泛的劑型，而片劑的成型機(jī)理卻是較復(fù)雜的。為了研究核黃素磷酸鈉片的成型機(jī)制，Guo 等借助 CLSM 觀察核黃素磷酸鈉與兩種不同型號(hào)的微晶纖維素(MCC)PH-101和 PH-102 的混合物在不同壓力下的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所壓制的片劑中藥物形成了結(jié)晶，進(jìn)而推斷出藥物成型機(jī)制為:在壓力作用下核黃素磷酸鈉所含水分溶解了藥物形成一層液膜，藥物發(fā)生重結(jié)晶，同時(shí)在壓力作用下，由內(nèi)部摩擦產(chǎn)生的熱引起藥物的熔化，當(dāng)熱量慢慢下降時(shí)，藥物呈燒結(jié)狀。通過此研究也發(fā)現(xiàn) MCC 是壓縮性較好的一種填充劑，在防止藥物在壓力下破碎起到了重要的作用。

早在 1995 年 Cutts 等發(fā)展了一種基于CLSM技術(shù)的新方法，可用于定量地監(jiān)控控釋制劑的藥物釋放過程，描述藥物從固體制劑中的釋放過程，找出合適的釋藥模型。Guo 等用 CLSM 研究支鏈淀粉水性包底衣對(duì)腸溶衣小丸抵制胃酸作用的釋藥機(jī)制。他們用 CLSM 研究了腸溶包衣小丸的釋藥過程，發(fā)現(xiàn)淀粉包底衣腸溶小丸比 HPMC 包底衣小丸在 0.1mol/L HCI溶液中的抗酸能力強(qiáng)。CLSM所得圖像及核黃素磷酸鈉鹽(RSP)的熒光分布圖與溶出結(jié)果一致:以淀粉包底衣能延緩溶出介質(zhì)向小丸丸芯滲透，從而減少了腸溶小丸在 0.1 mol/L HCI溶液中的釋藥。經(jīng)研究其釋藥機(jī)制是釋放介質(zhì)靠滲透壓進(jìn)入丸心溶解藥物，然后藥物再?gòu)陌履ぶ袛U(kuò)散出來(lái)。除此之外，Guo 等.進(jìn)一步用 CLSM 研究?jī)煞N含有不

同輔料的包衣丸藥物在包衣層的擴(kuò)散。通過 CLSM 在不同厚度包衣層中藥物熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定，較好地展示了以支鏈淀粉為輔料的包衣丸無(wú)藥物遷移，而以乳糖為輔料的包衣丸有較多的藥物遷移，因而影響藥物的釋藥性能。CLSM 結(jié)合數(shù)學(xué)模型用于研究藥物釋藥過程是其在藥學(xué)領(lǐng)域中的又一新應(yīng)用，使用 CLSM不會(huì)損壞樣品，可以清楚地觀察藥丸在水化作用下發(fā)生的變化，結(jié)合數(shù)學(xué)模型得到藥物制劑相應(yīng)的釋放方程及釋藥機(jī)制。目前關(guān)于 CLSM 在這一方面應(yīng)用的報(bào)道還較少。

展望

在只要領(lǐng)域，熒光顯微鏡已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究候選藥物于細(xì)胞的相互作用，而對(duì)于細(xì)胞成像，共聚焦顯微鏡在空間分辨率和數(shù)據(jù)質(zhì)量上已經(jīng)有了顯著的提高。

CLSM除了用于熒光物質(zhì)的成像外，還可以用反射光模式觀察費(fèi)熒光物質(zhì)的成像，例如，可用熒光激發(fā)模式和反射模式同時(shí)觀察熒光藥物在某個(gè)特定細(xì)胞或組織中的穿透情況和相互作用。

CLSM 還可與其它科學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，開辟新的研究領(lǐng)域。如和光譜結(jié)合可分析標(biāo)記物的熒光亮度，熒光壽命，光譜特點(diǎn)，通過對(duì)這些參數(shù)的研究可以了解目標(biāo)化合物和靶向生物分子的結(jié)合，從而可用于復(fù)雜的生化藥物篩選的定量分析。從這些眾多的熒光特性中，可以選擇最佳的參數(shù)作為篩選藥物定量分析的基礎(chǔ)，或者借助多參數(shù)分析鑒別化合物的研究技術(shù)成果和所起到的真正的藥理作用。

另外,CLSM 和多光子技術(shù)結(jié)合為動(dòng)態(tài)觀察和實(shí)時(shí)分析研究提供了可能。CLSM 存在激發(fā)波長(zhǎng)有限和時(shí)間分辨率不高的缺陷。然而，隨著CLSM 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展成熟和人們對(duì)CLSM技術(shù)認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，它在藥學(xué)研究領(lǐng)域必將得到更加廣泛和深入的應(yīng)用。