主要用途

植物氧化應(yīng)激活性氧（ROS）魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯米諾和強化劑的參與下，植物樣品中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族（過氧化氫）的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等）等的活性氧族的檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     220毫升

強化液（Reagent B）       1毫升

發(fā)光液（Reagent C）       1毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存強化液（Reagent B）和發(fā)光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于去除樣品雜質(zhì)

DOUNCE勻漿器：用于裂解植物組織樣品

超聲儀：用于裂解植物組織樣品

測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測化學(xué)發(fā)光

實驗步驟

一、 樣品預(yù)處理

1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的1毫升清理液（Reagent A）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管

10． 強力渦旋震蕩5秒，充分混勻

11． （選擇步驟）在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒

12． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

14． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

15． （選擇步驟）移取5微升進(jìn)行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白濃度為20毫克/毫升（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（1小時內(nèi)）

二、 測讀

測讀開始前，打開化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀1秒；然后關(guān)掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備好測試管，做好標(biāo)記：陰性對照、樣品本底和樣品活性

2． 移取400微升清理液（Reagent A）到陰性對照測試管

3． 移取400微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品本底測試管

4． 移取400微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品活性測試管

5． 分別加入10微升強化液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外

6． 分別加入10微升發(fā)光液（Reagent C）到上述測試管，除樣品本底測試管外

7． 輕輕渦旋混勻

8． 即刻放進(jìn)37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀（注意：建議瞬時測讀或30秒內(nèi)測讀）

9． 整合測讀1秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）

10． 或者測讀光電子讀數(shù)：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）

11． 計算ROS水平：

【（樣品活性－樣品本底）—陰性對照】 ÷ 0.4（毫升；樣品容量） ＝相對發(fā)光單位（RLU） / 毫升＝相對發(fā)光單位（RLU）/20毫克＝X 10⁶ CPM/毫升＝X 10⁶ CPM/20毫克

注意事項

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 測試前，樣品須新鮮收集，1小時內(nèi)為最佳

4． 樣品制備后即刻測讀，不宜過夜保存

5． 必要時，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理

6． 如果測定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化

7． 系統(tǒng)操作過程中，陰性對照只需測定一次

8． 測讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行

9． 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道

10． 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感