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【實(shí)驗(yàn)視頻】使用nanoDSF技術(shù)進(jìn)行片段化合物庫(kù)篩選
實(shí)驗(yàn)背景
Fragment-based drug discovery(FBDD)，是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的主流方法之一。它利用核磁共振技術(shù)（NMR）、X-射線單晶衍射（X-ray）以及熱遷移分析（TSA） 等方法篩選出與靶蛋白有弱相互作用的小分子片段，之后基于其結(jié)構(gòu)信息對(duì)活性片段進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得到更高活性的先導(dǎo)化合物進(jìn)行新藥的研發(fā)。
在篩選小分子片段時(shí)，NMR能在接近生理?xiàng)l件的溶液中獲得結(jié)合部位信息以及Kd，但其缺點(diǎn)為只能檢測(cè)比較小的蛋白，且樣品消耗量大。X-ray則需要先制備蛋白晶體，并且蛋白晶體和其在溶液中的構(gòu)象可能會(huì)有差異。此外，這兩種方法都需要非常昂貴的設(shè)備，通常只能在專(zhuān)用的平臺(tái)由專(zhuān)業(yè)操作人員協(xié)助開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
TSA（Thermal shift assay）通過(guò)檢測(cè)蛋白的熔解溫度Tm變化來(lái)進(jìn)行蛋白結(jié)合配體的篩選，其檢測(cè)速度快，實(shí)驗(yàn)門(mén)檻低。因此我們可以先使用TSA進(jìn)行初級(jí)篩選,之后結(jié)合NMR或X-ray進(jìn)行驗(yàn)證。TSA的主要技術(shù)有染料法以及無(wú)標(biāo)記的nanoDSF技術(shù)。在之前的文章中我們已經(jīng)介紹過(guò)這兩種技術(shù)的原理及對(duì)比, 小編今天將和大家分享荷蘭癌癥研究所（NKI）的研究人員發(fā)表在JoVE實(shí)驗(yàn)視頻期刊基于nanoDSF技術(shù)建立的片段化合物庫(kù)篩選Protocol。
doi:10.3791/62469
實(shí)驗(yàn)演示
實(shí)驗(yàn)小貼士
使用蛋白純度大于95%的均一蛋白
蛋白檢測(cè)濃度通常為200μg/ml, 本文中篩選768個(gè)化合物片段消耗～12ml蛋白，僅2.5mg
需要提前評(píng)估DMSO對(duì)蛋白的影響，本文中DMSO終濃度為0.2%
操作演示
1. 樣品配置
使用Mosquito robot進(jìn)行片段化合物配置_嗶哩嗶哩_bilibili
使用Mosquito robot進(jìn)行片段化合物配置
2.nanoDSF檢測(cè)
使用Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行TSA篩選_嗶哩嗶哩_bilibili
使用Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行TSA篩選
3.實(shí)驗(yàn)小結(jié)
基于此Protocol，研究人員對(duì)三種蛋白（癌癥高表達(dá)蛋白 Hec1，單極紡錘體蛋白激酶1 Mps1及新冠非結(jié)構(gòu)蛋白5,nsp5）進(jìn)行了DSi-Poised library（768個(gè)片段）的篩選。
研究人員指出使用搭載nanoDSF技術(shù)的Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀在進(jìn)行TSA篩選時(shí)有以下優(yōu)勢(shì)：
樣品消耗量低，要比其他方法少幾個(gè)數(shù)量級(jí)
除Tm外，還可同時(shí)檢測(cè)樣品的聚集情況。
傳統(tǒng)DSF方法，染料可能會(huì)干擾蛋白與配體間的結(jié)合
除了無(wú)標(biāo)記nanoDSF檢測(cè)模塊外，Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀還可搭載動(dòng)態(tài)光散射（DLS），靜態(tài)光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模塊，只需要10μl樣品就可以完成均一性，熱穩(wěn)定性，膠體穩(wěn)定性的檢測(cè)。同時(shí)我們還提供自動(dòng)化解決方案，便于客戶(hù)進(jìn)行無(wú)人值守的高通量篩選。
機(jī)械臂自動(dòng)上樣
NanoTemper用戶(hù)介紹
荷蘭癌癥研究所（NKI）成立于1913年，是荷蘭wei一的專(zhuān)業(yè)癌癥中心，一直以來(lái)也肩負(fù)著國(guó)際化科學(xué)與臨床專(zhuān)業(yè)知識(shí)、發(fā)展及培訓(xùn)中心的重要角色。該中心位于阿姆斯特丹，提供荷蘭國(guó)nei zui 佳的癌癥治療，并曾推動(dòng)了多項(xiàng)科學(xué)突破。（圖片來(lái)源bai du）
[1] Ahmad M , Fish A , Molenaar J , et al. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery[J]. Journal of Visualized Experiments, 2021(171).
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