植物如何平衡抗病和生長(zhǎng)發(fā)育平衡，zhong國(guó)科xue院分子植物科學(xué)卓yue創(chuàng)新中心何祖華團(tuán)隊(duì)研究揭示了以ROD1為免疫抑制中樞，通過降解超氧活性因子ROS，抑制植物的免疫反應(yīng)，平衡植物防御和生長(zhǎng)之間的沖突。

水稻中，ROD1編碼一種Ca²⁺傳感器蛋白，以Ca²⁺依賴的方式結(jié)合到磷酸肌醇脂質(zhì)，靶向至特定膜區(qū)域。ROD1刺激過氧化氫酶CatB的活性，促進(jìn)活性氧(ROS)清除，抑制免疫；當(dāng)有稻瘟菌侵染時(shí)，植物通過降解ROD1減弱其功能，產(chǎn)生有效的防衛(wèi)反應(yīng)。作者使用MST技術(shù)檢測(cè)ROD1可直接與Ca²⁺結(jié)合，并鑒定出活性結(jié)果位點(diǎn)。

圖注：MST技術(shù)分析ROD1與Ca²⁺的親和力和活性結(jié)合位點(diǎn)

另一方面，研究發(fā)現(xiàn)病原稻瘟菌中具有與ROD1結(jié)構(gòu)類似的毒性蛋白AvrPiz-t，在植物體內(nèi)盜用ROD1的免疫抑制途徑，實(shí)現(xiàn)侵染的目的，進(jìn)而與病原菌共同生存。通過MST檢測(cè)到AvrPiz-t與Ca²⁺結(jié)合，進(jìn)而盜用ROD1途徑。

圖注：MST技術(shù)比較ROD1和AvrPiz-t的Ca²⁺結(jié)合活性

質(zhì)膜定位受體樣激酶(RLKs)感知植物中保守的病原相關(guān)分子模式(PAMP)，觸發(fā)免疫(PTI)。擬南芥凝集素受體激酶LecRK-IX已被證明調(diào)節(jié)細(xì)菌鞭毛蛋白來源肽flg22誘導(dǎo)的PTI。而許多病原體分泌的效應(yīng)蛋白可抑制植物免疫。植物中是否存在某種機(jī)制抑制或削弱病菌分泌的效應(yīng)蛋白的功能？

中科院微生物所劉俊研究組研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白AvrPtoB是丁香假單胞菌的主要毒力效應(yīng)子。AvrPtoB C端有一個(gè)功能的E3連接酶結(jié)構(gòu)域，以植物中的鞭毛識(shí)別受體FLS2和幾丁質(zhì)識(shí)別受體CERK1為目標(biāo)進(jìn)行降解，導(dǎo)致PTI的抑制。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白AvrPtoB與擬南芥凝集素受體激酶LecRK-IX.2相互作用并泛素化降解LecRK-IX.2，抑制其介導(dǎo)的免疫。AvrPtoB在體外和體內(nèi)都能形成二聚體，這種二聚體形成對(duì)其E3連接酶與底物的結(jié)合和泛素化所必需的。然而, LecRK-IX.2能與AvrPtoB S335位點(diǎn)互作并使其磷酸化，S335的磷酸化破壞AvrPtoB二聚體狀態(tài)，導(dǎo)致其抑制PTI反應(yīng)的毒力下降。作者的研究表明，宿主RLKs可以修飾病原體效應(yīng)器，以抑制其毒性，并削弱其抑制PTI的能力。

圖示：AvrPtoB對(duì)LecRK-IX.2的泛素化與其被磷酸化競(jìng)爭(zhēng)模式圖

為了檢測(cè)AvrPtoB與自身以及與LecRK-IX.2親和力大小，作者進(jìn)行MST實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，AvrPtoB與LecRK-IX.2的親和力（0.02μM）要遠(yuǎn)高于其自身形成二聚體的親和力（18.7μM）,表明AvrPtoB更容易與LecRK-IX.2結(jié)合。

圖注：MST技術(shù)檢測(cè)AvrPtoB自身以及與LecRK-IX.2^CD

銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑，然而銅對(duì)病毒入侵的反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。之前的研究表明，SPL9介導(dǎo)的miR528轉(zhuǎn)錄激活為已建立的AGO18- miR528 - L- AO抗病毒防御增加了一個(gè)調(diào)控層。北京大學(xué)李毅課題組研究發(fā)現(xiàn)，Cu²⁺通過抑制SPL9的蛋白水平來抑制miR528的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而提高ROS水平，增強(qiáng)AO積累量及其酶活，從而加強(qiáng)抗病毒反應(yīng)，闡明了銅穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及SPL9-miR528-AO抗病毒途徑。

為了檢測(cè)SPL9和Cu²⁺之間的直接相互作用，作者純化了SPL9 DNA結(jié)合區(qū)域（SPL9 SBP），使用Monolith分子互作儀檢測(cè)其與Cu²⁺的互作。結(jié)果顯示SPL9 SBP直接與Cu²⁺結(jié)合，但不與Ca²⁺結(jié)合。

圖注：Monolith檢測(cè)SPL9與Cu²⁺親和力

此外，李毅課題組在2020年研究結(jié)果解析了植物體內(nèi)抗病毒RNAi信號(hào)通路，同樣用到了MST技術(shù)。

Yang, Zhirui, et al. "Jasmonate signaling enhances RNA silencing and antiviral defense in rice." Cell Host & Microbe 28.1 (2020): 89-103.

水稻抗病毒RNAi信號(hào)通路的核心蛋白AGO18受病毒侵染誘導(dǎo)，進(jìn)而增強(qiáng)水稻的抗病毒免疫；但是病毒侵染如何誘導(dǎo)水稻AGO18的了解很少。北京大學(xué)李毅課題組發(fā)現(xiàn)病毒外殼蛋白（CP）過表達(dá)能夠誘導(dǎo)水稻茉莉酸（JA）的顯著積累，JA信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（JAMYB）能夠結(jié)合并激活A(yù)GO18的啟動(dòng)子，從而誘導(dǎo)AGO18的表達(dá)，抑制病毒的侵染。

為了分析AGO18啟動(dòng)子上的順式作用元件，作者進(jìn)行了MST實(shí)驗(yàn)。將順式作用元件帶上FAM熒光，作為熒光信號(hào)源，檢測(cè)到JAMYB結(jié)合在AGO18啟動(dòng)子上的順式作用元件R3，R3突變后AGO18和JAMYB喪失結(jié)合能力，進(jìn)而確定了該位點(diǎn)對(duì)于AGO18轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要性。

圖3. MST檢測(cè)的JAMYB和AGO18 R3區(qū)域的結(jié)合（藍(lán)色曲線）

此外，作者通過MST實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水稻JAZ6蛋白能夠通過與JAMYB相互作用來抑制其轉(zhuǎn)錄激活活性，表明JAZ6抑制水稻抗病毒RNA沉默并損害水稻抗病毒免疫反應(yīng)。

圖2. MST檢測(cè)的JAMYB和JAZ6的結(jié)合

該研究揭示了植物JA信號(hào)通路與RNAi信號(hào)通路協(xié)同參與水稻抗病毒防御的分子機(jī)制。

植物寄生線蟲是全qiu性的糧食作物病蟲害之一，然而線蟲與宿主植物相互作用的機(jī)理仍尚不清楚。植物細(xì)胞膜上的受體蛋白FERONIA及其配體RALFs參與調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)。湖南大學(xué)和中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所聯(lián)合解析研究發(fā)現(xiàn)FERONIA突變導(dǎo)致植物對(duì)RKN表現(xiàn)出低敏感性。另外，作者在6類根結(jié)線蟲中鑒定了18種RALF-like基因，編碼的小肽可以直接結(jié)合到FERONIA的胞外結(jié)構(gòu)域，從而“挾持”植物FER信號(hào)途徑，破壞植物免疫系統(tǒng)，促進(jìn)寄生。

研究時(shí)，為了檢測(cè)了線蟲RALF- like小肽 MiRALF1/3是否同擬南芥At-RALF1具有相似的FER結(jié)合模式,作者使用MST進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示MiRALF1/3與FER^ECD親和力分別是25μM和64μM，而AtRALF1親和力略高，K_d為1.7μM，證明了線蟲RALF -like具有植物RALF的典型活性，且可以結(jié)合FER。

圖注：MST檢測(cè)FER^ECD與AtRALF1、MiRALF1或MiRALF3之間的親和力