干擾素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes, STING)在天然免疫中發(fā)揮重要作用，當(dāng)細(xì)胞被病原體(如病毒)感染時(shí)，STING可以誘導(dǎo)I型干擾素和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是靶向治療自身免疫疾病和癌癥的潛在靶標(biāo)蛋白。近年STING相關(guān)研究火爆，管線數(shù)量激增。目前quan球范圍內(nèi)在研的STING靶向藥物超過50種。

今天給大家介紹的STING抑制劑片段篩選案例是由NanoTemper和藥明康德旗下的Crelux公司合作完成的。研究人員生產(chǎn)純化了帶有His-tag的STING蛋白，隨后使用Prometheus蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行緩沖液優(yōu)化并使用環(huán)二核苷酸cGAMP作為陽性對(duì)照進(jìn)行Thermal shift assay，快速驗(yàn)證了蛋白的結(jié)合活性。案例回顧：差示掃描熒光法表征蛋白配體互作，不加染料的那種

接下來研究人員使用Dianthus完成了片段化合物庫單點(diǎn)篩選及親和力排序。

在使用Dianthus進(jìn)行篩選時(shí)，其中一個(gè)分子需要帶有熒光。本實(shí)驗(yàn)中, 研究人員使用His-tag熒光標(biāo)記試劑盒對(duì)STING蛋白進(jìn)行了特異性標(biāo)記，片段終濃度為500μM，結(jié)合緩沖液為50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, 0.005% TWEEN® 20, 4% DMSO。

STING片段篩選流程

下圖為單點(diǎn)篩選結(jié)果，2213個(gè)片段加上陽性及DMSO對(duì)照（均重復(fù)一次）總共采集了5376個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即14塊384孔板。消耗590μg STING蛋白,上機(jī)檢測(cè)時(shí)間約8h（Dianthus 33分鐘即可完成一塊384孔板檢測(cè)，↓ 文末觀看Dianthus上機(jī)演示）。紫色線框中的黃色數(shù)據(jù)點(diǎn)為陽性對(duì)照cGAMP，213個(gè)陽性化合物響應(yīng)值CV僅0.25%，檢測(cè)重復(fù)性非常好。

最后將單點(diǎn)篩選結(jié)果中的162個(gè)hits（上圖藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)）進(jìn)行12個(gè)濃度點(diǎn)的梯度稀釋檢測(cè)親和力。消耗STING蛋白190μg，上機(jī)檢測(cè)時(shí)間約3小時(shí)。

苗頭化合物驗(yàn)證

基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (FBDD) 是藥物研發(fā)的主流方法之一。但片段分子量低，且與蛋白靶標(biāo)親和力低，通常在μM-mM范圍，因此對(duì)篩選技術(shù)的靈敏度有較高的要求。Dianthus基于光譜位移技術(shù)（Spectral shift）檢測(cè)，不依賴于分子量，可檢測(cè)pM-mM的親和力。此外，Dianthus檢測(cè)一個(gè)k_d僅需1min，單孔上樣體積20μl，是您親和力篩選項(xiàng)目的強(qiáng)大工具！Dianthus產(chǎn)品介紹：全新Dianthus攜光譜位移技術(shù)橫空出世，1分鐘擊破親和力篩選難點(diǎn)！