單細胞基因組學技術目前正應用得如火如荼,比如單細胞RNA測序(scRNA-seq)和染色質轉座酶可接近性測序(ATAC-seq)。與傳統(tǒng)的大量細胞測序方法相比,單細胞基因組學技術突出了細胞之間的差異,有助于更深入地了解樣本材料。例如,scRNA-seq能夠比較健康和疾病狀態(tài)下的轉錄圖譜,而ATAC-seq能夠說明染色質可接近性及其對基因表達的影響。
不過,此類研究都需要對分離的細胞核進行準確計數(shù),因為文庫制備的要求是未裂解細胞的數(shù)量且樣本中不含細胞團塊和碎片。此外,許多單細胞基因組學技術都需要完整的細胞核才能正常運行。
細胞計數(shù)采用的方法?
臺盼藍染色法
臺盼藍染色是常用的對死活細胞進行分別計數(shù)的方法之一,染色原理是臺盼藍不能透過活細胞完整的細胞膜,故活細胞不著色;而死亡細胞的細胞膜損傷,染料透過細胞膜在細胞內富集而使細胞著藍色。不過,臺盼藍染色并不一定能準確分辨有核細胞和細胞碎片,因此它往往低估細胞總數(shù)而高估細胞活力。
熒光細胞計數(shù)方法
吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色原理:活細胞經AO染色發(fā)出綠色熒光,而死細胞經PI染色發(fā)出紅色熒光。重要的是,對背景復雜的細胞,比如說外周血單個核細胞,含有細胞碎片較多或成簇的細胞計數(shù),避免了細胞碎片的檢測。這種方法近也應用在單細胞基因組學應用上,其中綠色對應了完整細胞,而紅色對應了成功分離的細胞核。這種策略讓研究人員能夠計算未裂解的殘留細胞占總細胞數(shù)的百分比,同時對細胞核進行計數(shù),提示樣本質量,幫助研究人員確定是否繼續(xù)進行單細胞基因組學流程。
全自動熒光細胞分析儀明場+雙色熒光通道的結合使實驗更加簡單快捷,同時還具備轉染檢測功能,更加拓寬了檢測的寬度。檢測細胞種類更加龐大,不僅適用于單純的培養(yǎng)細胞,對從組織中、骨髓中、外周血、肺泡中、肝臟中分離出的種類和來源差異較大的細胞標本,也可以快速的計數(shù)和分析。通過熒光標記技術和圖像分類識別技術對顯微獲取的熒光數(shù)字圖像自動進行分析,獲取細胞的死活狀態(tài)、凋亡情況以及實現(xiàn)細胞的分類。
技術參數(shù):
1、檢測模式多樣:非染色計數(shù)+染色計數(shù)+雙色熒光計數(shù)+人工校準模式+轉染
2、自動對焦,無需人工干預調焦
3、全自動載物臺:可實現(xiàn)X、Y方向自動運動;符合顯微鏡計數(shù)標準,可自動采集4個標準面積區(qū)域;
4、像素:1000萬彩色相機;
5、檢測細胞直徑范圍:2-200μm;
6、測量細胞濃度范圍:0.25x104-3×107個/mL;
7、可兼容重復使用標準玻璃計數(shù)板;
8、圖像采集:點擊計數(shù)鍵,儀器自動拍攝4個區(qū)域圖像,自動完成采集、存儲功能、識別、統(tǒng)計、生成報告等;圖像可進行多通道疊加,圖像可調節(jié)亮度
9、具備復孔計數(shù)模式:可自動獲取同一計數(shù)片上兩個樣品槽中的細胞圖像,軟件自動計算平均值,結果更精準
10、模式識別功能:細胞碎片排除分析;成簇細胞的單個細胞計數(shù);不規(guī)則細胞計數(shù);提供的數(shù)據(jù)分析圖表包括但不限于:細胞直徑分析;細胞直徑均值分析;細胞大小直方圖;細胞直徑-亮度散點圖;細胞直徑-亮度等高線圖;生長曲線圖;聚團分布圖;四個區(qū)域細胞原始圖;四個區(qū)域細胞死活識別標識圖;四個區(qū)域拼接圖;提供拼圖看圖工具,所有計數(shù)歷史數(shù)據(jù)均可隨時調出查看及追溯。
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