單細胞力譜在生命科學、細胞生物學研究中起著至關重要的作用。細胞的力學特性直接反映了細胞的生理狀態(tài)，高通量測量單細胞的力學特征在疾病的診斷和治療中具有廣泛的應用前景。然而傳統手段卻有著諸多局限^[1]，這主要原因是缺乏一種能夠簡單、高效抓取細胞并進行力學測定的手段^[2]。多功能單細胞顯微操作FluidFM技術的出現給單細胞力學的研究帶來了新的希望。該技術結合了原子力顯微成像技術與微流控技術，能夠通過中空的原子力探針將微球或細胞輕松進行抓取，進而通過細胞與細胞、細胞與基質、微球與細胞等相互作用的方式，進行nN到μN級別的細胞水平的力的測量。

FluidFM技術源自瑞士ETH，一經問世就*改變了單細胞水平科學研究的研究方式。目前，FluidFM技術主要有兩種解決方案，一是FluidFM OMNIUM一體機系統（單細胞顯微操作系統），可以自動、高效的完成單個細胞的注射、提取、分離以及單細胞力譜測定。主要應用于活細胞單細胞測序Live-Seq，活細胞線粒體移植，CRISPR-Cas9基因編輯，細胞系構建等方面；另外一個方案是FluidFM ADD-ON系統（單細胞力譜檢測系統），它主要是用于單細胞力譜測定方面，具有操作簡單、適用細胞種類多、通量高、力學范圍寬等優(yōu)勢。

FluidFM技術給研究者帶來了一種高效、低損的方式來抓取細胞的力學測定方案，能夠真正意義上的做到精準、無損、快速的測量單細胞力譜，幫助研究者尋找細胞力學特征與細胞生長發(fā)育、腫瘤細胞轉移之間的關系。本文將對使用FluidFM ADD-ON進行單細胞力學研究的應用案例進行總結。

FluidFM ADD-ON單細胞力譜檢測系統

1. 真核細胞與不同類型基底之間的粘附特性研究

組織工程中仿生和響應界面方面的研究開發(fā)是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。Cell-ECM相互作用可以直接調節(jié)細胞粘附，遷移，生長，分化和凋亡，Sankaran等^[3]使用FluidFM技術研究了小鼠成肌細胞C2C12單細胞與共價表面、非共價表面整合素受體底物之間的相互作用情況（圖1a）。

用FluidFM探針抓取單個C2C12細胞后，控制細胞探針在基底(非共價表面和共價表面)上進行Z軸方向的運動，并記錄圖2(a)中的力曲線。由力學曲線可以得出反映細胞與基底脫離的幾個具體參數，包括粘附力圖2(b)、剝離距離圖2(c)和總功2(d)，這些參數可以定量反映細胞與基底之間的粘附相互作用情況。

圖1 FluidFM技術的原理示意圖。圖中顯示細胞抓取前后的鏡下照片。

圖2 細胞與FluidFM懸臂梁接觸后即開始的代表性力-距離曲線。獲得粘附力、剝離距離、總功等數據。

本研究利用FluidFM技術簡易、高效的完成了單細胞力譜的測定，結果表明，雖然與共價表面相比，生物活性配體在非共價表面上通過相對較弱的力結合在一起，但共價和非共價兩種表面的總細胞粘附力非常相近。進一步探究其機理表明，粘附在共價和非共價表面的細胞之間的肌動蛋白絲、局部粘附、粘附力和細胞收縮力等是相近的。

2. 真核細胞之間的粘附力測定

細胞在基質上進行單層培養(yǎng)時，吸附在基質表面時主要有兩種不同類型的力，一種是細胞與基質之間的粘附力，另一種是細胞與細胞之間的粘附力。因此對于細胞粘附力來說，單個細胞的粘附力就是細胞與基質之間的作用力。而單層細胞的粘附力則是細胞之間相互作用力和細胞基質與細胞之間作用力之和。因而細胞間的相互作用力則可以通過同時測量單層細胞的細胞粘附力和單個細胞的粘附力做差即可得到，如下公式所示：

Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cell

為了能夠測量粘附力Sancho等^[4]使用FluidFM 技術，將探針靠近細胞至探針與細胞接觸，之后開始對探針腔內增加負壓從而牢固的吸住細胞。當細胞被抓取后通過儀器位移臺的移動抬高探針并記錄過程中的力學變化，如下圖所示：

圖3 FluidFM對單個細胞及細胞層粘附力測量的示意圖及細胞粘附力柱狀圖。

從圖中顯示出當探針開始靠近細胞后，探針表面開始出現壓力變化，如（圖3b）中的藍色區(qū)域所示。當出現這種變化后就停止下降探針并開始施加負壓。這時候由于腔內負壓，探針和細胞之間的結合變得緊密，導致探針被細胞向下拉動，從而產生了（圖3b）中白色區(qū)域的力學變化。隨后隨著探針上升，細胞給以探針的拉力隨之增高，并逐漸達到臨界，使得細胞脫離基質。這一過程的峰值即為細胞粘附力。

通過FluidFM技術，作者發(fā)現，單層的L929成纖維細胞表現出的細胞與細胞間的粘附力可以忽略不計，而來自HUVEC的細胞在每個細胞中都發(fā)揮著強大的細胞間粘附力。

3. 楊氏模量Young’s Modulus

內皮細胞-間充質轉化(Endothelial-to-Mesenchymal Transition, EndMT)可以引起血管重塑，Sancho等^[4]使用一種基于MSX1 (Muscle Segment Homeobox 1)過表達的體外模型來誘導EndMT，并應用FluidFM技術對EndMT早期單層細胞的力學特性進行了測定。

Sancho通過表觀楊氏模量作為細胞剛度的特征參數來描述細胞自身的生物力學特性。測量是通過在FluidFM探針頂端抓取一個微珠，并在細胞的核區(qū)域進行小凹陷來完成的(圖4d,e)。選用探針的懸臂梁的彈簧常數為0.2 N/m，孔徑為4 μm。將直徑為10 μm的聚乙二醇包覆聚苯乙烯珠(Micromer #01-54-104, Micromod Partikeltechnologie GmbH, Germany)固定在懸臂的孔徑處，將密度為5 μg/mL的小珠添加到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。通過施加700 mbar的吸壓抓取珠子，并校準偏轉靈敏度。接下來，將探針移動到裝有細胞的蓋玻片的培養(yǎng)皿 (圖4e)。從懸臂開始，在5 μm的距離上在單層細胞的細胞核上進行壓痕。該方法通過儀器內部的位移臺以500 nm/s的速度完成，直到達到2 nN的設定值，數據采集頻率為2000 Hz。每一個壓痕都有2s的停頓和5 μm的收縮距離。在實驗過程中，在300 mbar的負壓下，微珠被保留在頂端。采用改進的赫茲模型擬合球形壓頭的力(nN) -壓痕(nm)曲線與球形壓痕修正的赫茲模型(圖4f,g)擬合計算出表觀楊氏模量，其中F為力，E為楊氏模量，R為球形壓痕半徑，&壓痕，v為泊松比，本研究設置為0.5。公式如下：

圖4 FluidFM 技術楊氏模量檢測示意圖，MSX1過表達的樣本細胞剛度增加。

通過計算表觀楊氏模量(Young’s Modulus)，作者發(fā)現，MSX1過表達細胞的剛度明顯大于對照細胞(圖4h)，其值大約是對照細胞的兩倍(克隆1從760 Pa到1530 Pa，克隆2從1565 Pa到2523 Pa)。結果表明，在EndMT過程的早期，HUAECs的彈性特性已經發(fā)生變化，導致剛度增加。這些變化與已知的細胞骨架重組相一致，該重組可實現細胞的動態(tài)伸長和定向運動。

4. 細胞彈性譜圖

單個活細胞的力學特性已被證明是細胞生理狀態(tài)的重要指標。細胞體與細胞外基質(ECM)邊界的肌動蛋白皮層(AC, actin cortex)由質膜和肌動蛋白細胞骨架組成，通過豐富的跨膜和適配器蛋白連接在一起。AC的結構和生物力學緊密交織在一起，進而影響分子機械傳感器的功能。

基于FluidFM技術的研究數據提供了關于細胞力學特征的豐富信息。Lüchtefeld等^[5]在楊氏模量的基礎上提出了一個擴展的分析方法，以進一步明確解釋肌動蛋白皮層的特性，即彈性譜（Elasticity Spectra），用來計算細胞的胞體表觀剛度與壓痕深度的函數關系。彈性譜方法在一組細胞骨架影響藥物處理的細胞上進行了測試和驗證，顯示了擴展當前細胞力學表征的潛力。

使用FluidFM進行彈性譜測量的具體實驗方案是：選用孔徑為2 μm、彈簧常數為0.3 N/m的FluidFM探針進行實驗。將探針的孔道中填充含有0.1 mg/ml藍色熒光染料AMCA(7-氨基-4-甲基Coumarin，Sigma-Aldrich, USA)的生理溶液，用于堵塞檢測。將直徑為3 ~ 4 μm的綠色熒光珠(Phosphorex Inc, USA)放置在融合細胞層旁，通過微探針施加800 mbar的負壓壓力將其抓取在探針頂端。壓痕以1 μm/s的接近速度和100 nN的力設定值在5 × 5點的網格上進行，間距為25 μm。

圖5 半徑為R的球形探針在具有楊氏模量的柔性材料上進行納米壓痕實驗示意圖。并獲得127條細胞力-壓痕曲線的典型實驗數據集。

圖6 單細胞彈性譜實驗方案示意圖。并獲得 315個細胞的力-壓痕曲線數據集。

基于FluidFM技術進行的彈性譜ES的雙層模型為更高通量的篩選影響AC力學的藥物，評估環(huán)境或生理病理條件對AC動力學的，以及研究細胞內力對細胞力學敏感性的影響提供了一個有價值的工具。

5. 原核細胞間相互作用力

白色念珠菌在醫(yī)院的慢性疾病患者中經常形成耐藥生物膜。細胞粘附和生物膜的形成涉及細胞表面Als (agglutinin-like sequence)蛋白家族。在機械應力下，Als蛋白的淀粉樣簇可以激活細胞粘附。

Dehullu等人^[6]使用FluidFM技術對酵母菌Als蛋白的功能進行了研究，具體實驗方案是通過儀器系統的負壓將一個酵母細胞固定在FluidFM空心探針上，另一個酵母細胞被物理性地阻隔在多孔膜中(圖7，A)。用熒光染料染色對酵母細胞的活性和細胞的完整性進行標記(圖7,B)。然后，通過FluidFM來記錄力學曲線，測量不同條件下酵母細胞之間的相互作用情況，如在改變淀粉樣蛋白序列或降低細胞表面的蛋白質密度等。

圖7 使用FluidFM技術檢測酵母-酵母細胞之間的相互作用力。

利用FluidFM技術，可以很容易地通過施加負壓力將單個原核細胞固定在FluidFM中空探針上，進而可以測量微生物之間的相互作用力。文章結果表明，Als5蛋白在粘附細胞上的同源性結合是真菌聚集的主要方式。由于在許多微生物黏附素中發(fā)現了潛在的淀粉樣蛋白形成序列，作者推測這種基于淀粉樣蛋白的同源性黏附的新機制可能廣泛存在，并可能成為治療生物膜相關感染的一個有意義的靶點。

6. 微球與固定細菌之間相互作用

Mittelviefhaus^[7]等通過FluidFM技術開發(fā)并應用了一種通用而高通量的方法來量化不同細菌細胞與基質之間的粘附情況。具體實驗方案是：二氧化硅微球通過FluidFM探針的通道負壓方便可逆地固定。該微球用于探測與固定在多巴胺涂層玻璃上的細菌的相互作用。通過聚多巴胺涂層將目標細菌固定在玻璃表面，以防止測量過程中細菌的位移(圖8a)。將微球與一個單獨的細菌接觸——這一過程在顯微鏡的光學成像系統下進行。在達到10 nN后，接觸保持5 s，然后收回懸臂并記錄力學曲線 (圖8b)。

然后再次使用該微球來測量與另一個細菌細胞的粘附力；進而，通過一個短的超壓脈沖將第一個微球放下，然后通過相同的探針可以很容易地抓取另一個新的微球而進行后續(xù)的實驗。這樣便實現了細菌細胞的高通量力學測量。

圖8 FluidFM技術檢測細菌與基質之間的粘附力

研究結果證實了疏水性在細菌起初附著在其自然宿主葉片上的作用情況。細菌粘附是細菌表面定植和群落形成的第一步。本文使用FluidFM技術可以可逆地固定功能化微球作為表面模擬物，并探測單個細菌的粘附。作者對不同大小和形態(tài)的葉片分離物進行了系統發(fā)育多樣性的單細胞力譜分析。對28株細菌的粘附測定顯示，疏水相互作用的差異較大，約為3個數量級。細菌的粘附力可高達50 nN。不同分離株的疏水性與細菌在植物中的滯留量呈正相關，這可能為病原菌成功的葉片定殖和潛在的病害暴發(fā)提供依據。

綜上所述，細胞水平的力學研究常用的方法是利用包被的AFM探針，目前缺乏一種能夠在不改變細胞性質的同時測量細胞整體粘附力的方案。FluidFM 技術的出現改變了這一狀況。高精密的中空微流控探針能夠在精準感知壓力的同時通過內壓而非蛋白結合的方式牢固地抓取細胞而不改變細胞性質，為單細胞力譜的測定打開了全新的局面^[8]。

瑞士Cytosurge 推出的全新的FluidFM 技術給單細胞力譜研究帶來了全新的解決方案。這種技術結合了原子力顯微鏡探測技術與精密的微流體控制系統，直接使用中空的原子力探針將細胞通過負壓抓取在探針表面，而不需要激活細胞的任何通路信號，為粘附力等細胞層面的力學測量帶來了很大的優(yōu)勢。一方面，這種方法能夠提供遠比蛋白結合牢固多的粘附力，將細胞牢固地固定在探針上面，因此能夠直接從基質上分離。而另一方面，由于沒有生物處理，這種方法不會改變細胞表面的任何通路，從而能夠得到接近細胞原生的數據。

FluidFM® ADD-ON是一種更高效的單細胞力譜解決方案。如果您對FluidFM技術其他的應用感興趣，例如活細胞單細胞提取Live-Seq^[9]，活細胞線粒體移植，CRISPR-Cas9基因編輯，單細胞注射^[10]、提取、細胞系構建等，請選擇FluidFM® OMNIUM一體機，詳細信息請聯系Quantum Design中國公司專業(yè)技術人員咨詢，聯系電話：010-85120280，郵箱：info@qd-china.com，謝謝！

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