本文闡述了DELFIA® EuTDA法在不同場景中，如：CAR-T、CAR-NK和抗體依賴的細胞毒性（ADCC）檢測細胞殺傷功能的應(yīng)用。該方法靈敏度高，特異性好，適用范圍廣等優(yōu)勢，得到廣泛的認可。

技術(shù)原理介紹
靶細胞與BATDA共孵育，BATDA進入細胞后，被內(nèi)酯酶裂解形成TDA，親水性的TDA不能再穿過細胞膜屏障。與效應(yīng)細胞共孵育，啟動殺傷效應(yīng)將靶細胞中的TDA釋放到上清液中，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測板上，并化合物溶液結(jié)合生成熒光分子EuTDA。細胞裂解導(dǎo)致EuTDA的增加，因此信號的增加與標記的靶細胞群的細胞死亡相關(guān)。

注：下文中BATDA法亦指DELFIA®EuTDA法。

CAR-T殺傷功能評價
嵌合抗原受體(CAR)T細胞治療是適應(yīng)性免疫治療的前沿。CAR-T細胞是由T細胞設(shè)計而來的，通過促進癌細胞表面的相互作用來特異性地靶向腫瘤細胞。CAR-T細胞的激活導(dǎo)致了由CAR-T細胞產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子產(chǎn)生的細胞信號通路的增加，以幫助破壞靶向腫瘤細胞。

Zhicai Lin等人在《Evaluation of Nonviral piggyBac and lentiviral Vector in Functions of CD19 chimeric Antigen Receptor T Cells and Their Antitumor Activity for CD19+ Tumor Cells》一文中使用BATDA法評價病毒轉(zhuǎn)座子（piggyBac）和慢病毒載體（LV）轉(zhuǎn)染對CAR-T細胞殺傷的功能分析。1×105Raji細胞在37°C下用BATDA標記30 min，后用PBS洗滌三次以去除多余的BATDA。CD19pb CAR-T細胞和CD19lv CAR-T細胞添加到BATDA標記Raji細胞96孔V底板，效靶（E:T）比16：1，8：1，4：1，2：1和1：1，37°C，5%CO2條件下孵育4小時。取上清，加入Eu solusion，選擇酶標儀TRF讀板。

與Mock T細胞相比，CD19pbCAR-T細胞和CD19lvCAR-T細胞均具有較高的細胞毒性。雖然CD19pbCAR-T細胞在E：T為4：1和16：1時殺死CD19+WTRaji細胞，但CD19pbCAR-T細胞在任何E：T下對CD19KORaji細胞沒有細胞毒性。CD19pbCAR-T細胞用于靶向CD19的ScFv具有特異性和有效性。

CAR NK殺傷功能評價
CAR-T細胞是常用的效應(yīng)細胞類型，然而使用CAR-T細胞進行治療可能與危及生命的毒性作用有關(guān)，如細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性。此外，腫瘤細胞可能發(fā)展出免疫逃逸策略，如抗原丟失，阻止CAR-T細胞識別。相比之下，CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細胞是具有更多短暫毒性的短壽命細胞。此外，NK細胞的細胞毒性可以通過刺激和抑制受體以CAR獨立的方式，增加抗腫瘤活性。

Alejandra Leivas等人在《NKG2D-CAR-transduced natural killer cells effificiently target multiple myeloma》一文中采用BATDA法進行體外殺傷功能檢測。NKAE和T細胞產(chǎn)物對MM細胞的EuTDA釋放試驗評估細胞毒性。以U-266、L-363、OPM-2骨髓瘤細胞和原代多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞作為靶細胞，與效應(yīng)細胞按定的靶細胞（E：T)比例孵育4小時。為了檢測CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細胞的安全性，我們以供體PBMC、CCD-18Co和NL-20細胞系為靶點，進行了細胞毒性試驗。

NKAE細胞對U-266MM細胞系表現(xiàn)出強大的細胞毒性活性，在最大E：T比值（32：1）時，破壞了77.7%的MM細胞。與NKAE細胞相比，CAR-NKAE細胞表現(xiàn)出更好的細胞毒性，在E：T為8：1已破壞*的MM細胞。與CAR T相比，CAR-NKAE對MM細胞系表現(xiàn)出更強的細胞毒性。

抗體依賴的細胞毒性ADCC
在防御入侵病原體的過程中，免疫球蛋白由B細胞形成的。它們通過其Fab結(jié)構(gòu)域與病原體結(jié)合，隨后通過免疫球蛋白Fc受體激活補體和免疫細胞。最大的部分是免疫球蛋白γ（IgG）抗體，它通過髓系和自然殺傷（NK）細胞上的Fcγ受體（FcγR）介導(dǎo)其效應(yīng)功能。抗體依賴性細胞毒性（ADCC）是IgG的主要Fc依賴的效應(yīng)功能之一，在清除病毒感染中尤為重要，主要由NK細胞介導(dǎo)。

Steven W等人在《FcγR Binding and ADCC Activity of Human IgG Allotypes》研究中分別對抗CD20，抗CD52，抗RhD和抗TNP抗體ADCC進行了評價。IgG2和IgG4沒有誘導(dǎo)NK細胞介導(dǎo)的ADCC活性，這與其與FcγRIIIa的結(jié)合很弱相一致。在IgG1能有效且類似地誘導(dǎo)ADCC（~70%殺傷），在IgG1之間沒有觀察到差異，在IgG3中，誘導(dǎo)ADCC的能力差異很大，從20%到80%，這僅與SPR測量的親和力差異部分匹配。為了確定我們的發(fā)現(xiàn)是否具有抗原依賴性，我們還在一個以TNP化紅細胞作為靶細胞的平行實驗中分析了抗TNP IgG的ADCC能力?？筎NP ADCC數(shù)據(jù)與抗RhD抗體的ADCC數(shù)據(jù)非常相似。

DELFIA® EuTDA法綜合評價
中檢院曾發(fā)文題為《免疫細胞治療制劑體外殺傷效力評價》，文中對51Cr 、BATDA 、CAM 、CytoTox-Glo 、PKH、EliSpot和LDH法進行了殺傷效果評價。其中51Cr同位素法是檢測殺傷的金標準，結(jié)果總結(jié)，BATDA法與51Cr 釋放法的平行性最好，作用時間明顯縮短，可重復(fù)性高，對懸浮靶細胞和貼壁型靶細胞均具有很好的適用性?？芍貜?fù)性好，可以滿足免疫細胞體外殺傷效力檢測的需要。

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DELFIA®EuTDA需要使用搭載有相應(yīng)模塊（TRF）的酶標儀進行讀值，優(yōu)寧維推薦PerkinElmer VICTOR Nivo™ 多功能酶標儀：