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瑋馳小課堂 | Lonza 384孔高通量電轉(zhuǎn)應用

來源:上海瑋馳儀器有限公司   2022年07月07日 09:15  

 


當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找的、有效的、安全的藥物靶點將成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學和創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。


CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具,因為它易于使用,并且與其他基因調(diào)節(jié)工具(例如siRNA技術(shù))相比,脫靶效應更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫,已被廣泛用于靶點識別和機制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時更少,但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點功能分析中提供了更多的技術(shù)靈活性。此外,與混合文庫的 CRISPR 方法相比,陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關(guān)性通常更加直接。


 

全基因組CRISPR篩選以識別人肝星狀細胞中TGF-β誘導的肝纖維化的驅(qū)動因素

2022年3月11日,Takeda公司的開發(fā)團隊在ACS Chem Biol上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章,為了進一步了解肝纖維化的驅(qū)動機制,作者開發(fā)了一個高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺來鑒定肝星狀細胞(HSC)來源的TGF-β誘導的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學表型篩選平臺揭示了TGF-β誘導的肝纖維化的新生物學機制和肝纖維化的潛在藥物靶點


 

作者使用ACTA2蛋白表達作為HSC激活的水平,首先確認了HSC對TGF-β的反應,并確認了進行CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)染條件,包括電脈沖參數(shù),crRNA及tracrRNA濃度,轉(zhuǎn)染的細胞數(shù),鋪板密度等。


 


隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進行高通量篩選敲除潛在靶基因,通過計算ACTA2表達的抑制百分比及細胞活率,終從19,027個基因中篩選出了52個基因,其中部分基因為已經(jīng)被預測可以通過傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物來調(diào)節(jié)干預。


 


為了確認這些基因在改善HSC纖維化方面的作用,作者在HSC中單獨敲除了這些基因,并評估這些基因的缺失對TGF-β誘導的14種生物標志物轉(zhuǎn)錄譜的影響。


 


同時,構(gòu)建器官型肝模型進行共培養(yǎng),評估纖維化模型中上述基因的表達水平。與GEO profiles數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的公開可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比分析。結(jié)果進一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發(fā)病過程中對HSC的潛在調(diào)控作用。


 


對生物標志物轉(zhuǎn)錄譜影響的實驗中,作者發(fā)現(xiàn)PSMC2的缺失可以抑制多個標志物,并進一步確認小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導的HSC活化。


 


隨后,作者評估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗中候選基因的表達水平,確認了這些候選基因在HSC中特異性富集。

作者還在UK Biobank上進行了MAGMA分析,確認部分基因的遺傳變異可能會影響NASH和肝纖維化的生物標志物。

作者總結(jié)了這些研究的結(jié)果并對每個靶基因進行了評分。更高的分數(shù)表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標。


 

總之,作者通過構(gòu)建肝纖維化的生理模型,通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺從19,027個基因中篩選出52個潛在基因可能在激活的HSC誘導的肝纖維化中起作用,通過一系列的驗證及對比并為10個基因進行評分,這些基因?qū)殚_發(fā)下一代肝纖維化療法提供了進一步可能。


當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找的、有效的、安全的藥物靶點將成為創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具,在短時間內(nèi)完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。


在近幾年的科學研究中,我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選,siRNA篩選以及細菌的CRISPR-Prime編輯的工作中。


384-8.jpg


  • 基于成熟的 Nucleofector 技術(shù)

  • 快速 —— 1分鐘內(nèi)處理一個384孔板

  • 易于使用 —— 使用現(xiàn)有的96 孔 Shuttle 方案

  • 低材料消耗與高性能結(jié)合 —— 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)可低至2×10?

  • 自動化兼容 —— 專為集成到液體處理平臺而設(shè)計

 

基于20年在外源基因轉(zhuǎn)導方法的開發(fā)經(jīng)驗,及的客戶反饋,Lonza開發(fā)出的4D-NucleofectorTM以靈活性和可靠性滿足客戶的需求。除384-well Nucleofector外,Lonza還可以提供不同維度的轉(zhuǎn)染模塊來應對不同的場景需求



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