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微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞與動物細(xì)胞在培養(yǎng)上的區(qū)別
微生物細(xì)胞培養(yǎng)，簡稱微生物培養(yǎng)，包括原核細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)菌培養(yǎng))和真核細(xì)胞培養(yǎng)(霉菌培養(yǎng)和酵母培養(yǎng))。這些細(xì)胞小、且具有細(xì)胞壁，細(xì)胞周期非常短，如細(xì)菌每20-30min增殖1次。
植物細(xì)胞培養(yǎng)指原生質(zhì)體培養(yǎng)。未考慮分離出原生質(zhì)體的植物細(xì)胞培養(yǎng)，無論是游離的單細(xì)胞或組織塊，都稱作植物組織培養(yǎng)。
動物組織細(xì)胞培養(yǎng)包括接種單細(xì)胞懸液進(jìn)行的培養(yǎng)、接種組織塊進(jìn)行的培養(yǎng)。傳代細(xì)胞如細(xì)胞株、細(xì)胞系，通常采用接種單細(xì)胞懸液進(jìn)行的培養(yǎng)，是動物細(xì)胞培養(yǎng)常見的方式。原代細(xì)胞是指來源于動物組織的細(xì)胞團(tuán)塊，往往包含多種細(xì)胞類型，并且細(xì)胞與細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)膜有緊密聯(lián)系。如果培養(yǎng)時不需分離組織中的細(xì)胞，直接用組織塊進(jìn)行的培養(yǎng)就是組織培養(yǎng)。如果需要制備成單細(xì)胞懸浮液，再接種培養(yǎng)，則屬于一原代細(xì)胞培養(yǎng)。
一、細(xì)胞型微生物培養(yǎng)
細(xì)胞型微生物包括原核細(xì)胞類微生物和真核細(xì)胞類微生物。細(xì)菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體和立克次氏體等一般屬于單細(xì)胞原核生物，放線菌是菌絲生長，其菌絲由多細(xì)胞組成，但每個細(xì)胞往往含多套核物質(zhì)，屬于無隔菌絲。酵母一般是單細(xì)胞真核生物，霉菌往往是多細(xì)胞真核生物。霉菌菌絲多數(shù)時候是有隔菌絲，每個細(xì)胞一般含1個細(xì)胞核或2個以上的細(xì)胞核。
(一)培養(yǎng)目的
根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀的差異，分為3種類型：①液體培養(yǎng)，用于增菌培養(yǎng)、鑒別培養(yǎng)等目的；②固體培養(yǎng)，這種培養(yǎng)的目的有增菌、分離、鑒別、保藏等；③半固體培養(yǎng)，一般用于鑒別和增菌目的。
(二)培養(yǎng)形式
在液體培養(yǎng)類型中，常見發(fā)酵管培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、多孔板培養(yǎng)等形式。在固體培養(yǎng)類型中，培養(yǎng)皿平板、克氏瓶(扁瓶)平板、試管斜面為常見形式。
(三)培養(yǎng)儀器
原核細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)箱是生化培養(yǎng)箱或厭氧培養(yǎng)箱，前者用于好氧菌培養(yǎng)，后者用于厭氧菌培養(yǎng)，厭氧培養(yǎng)需要鋼瓶提供食品級氮氣。霉菌培養(yǎng)箱用于霉菌培養(yǎng)，能提供較高的相對濕度，氣密性也比較高。
二、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)
植物組織培養(yǎng)是指通過無菌操作分離植物體的一部分，即外植體，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)主要有原生質(zhì)體培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)等形式，其中最常見的是愈傷組織培養(yǎng)。
(一)培養(yǎng)目的
由于植物細(xì)胞具有全能性，植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的各種類型均可經(jīng)過誘導(dǎo)分化形成愈傷組織，發(fā)育形成新植株。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅用于快速繁殖，而且有著相當(dāng)廣泛的用途。這些應(yīng)用包括單倍體育種、種質(zhì)保存、生理學(xué)研究和基因轉(zhuǎn)化等。
(二)培養(yǎng)類型
1.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)
植物細(xì)胞培養(yǎng)，狹義上僅指植物原生質(zhì)體培養(yǎng)，廣義上包括植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)。
脫除細(xì)胞壁后的植物細(xì)胞稱為原生質(zhì)體。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是將來源于某個植物器官的組織塊中的細(xì)胞，用纖維素酶或果膠酶等降解細(xì)胞壁，離心收集得到單細(xì)胞懸液，然后接種培養(yǎng)。其特點是：①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA;②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；③與完整細(xì)胞一樣具有全能性，仍可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。
2.植物組織培養(yǎng)
包括莖尖分生組織或愈傷組織培養(yǎng)。其中，誘發(fā)產(chǎn)生的愈傷組織，在條件適宜情況下，可培養(yǎng)出再生植株。用于以下目的：①研究植物的生長發(fā)育、分化和遺傳變異；②進(jìn)行特定品種的克隆，即無性繁殖；③制取特定植物組織細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。
3.懸浮植物細(xì)胞培養(yǎng)
在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)。適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。
4.花藥培養(yǎng)
也稱單倍體培養(yǎng)。通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株，經(jīng)人為加倍后可得到*純合的植株或品種。
5.植物器官培養(yǎng)
植物器官培養(yǎng)是指將植株的胚、花藥、子房、根或莖在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。
(三)培養(yǎng)條件
人工培養(yǎng)條件，即人工環(huán)境，包括：①提供能量來源的光照條件；②保證新陳代謝的溫度條件；③提供氣一水平衡的濕度條件；④提供生物原料來源的培養(yǎng)基；⑤避免環(huán)境微生物污染的無菌環(huán)境。人工環(huán)境模仿了植物的自然環(huán)境，即光照、溫度、濕度、土壤和完整植株體內(nèi)無菌環(huán)境。
光照、溫度的選定通常依據(jù)所培養(yǎng)植物的生態(tài)習(xí)性，習(xí)慣上采用暗培養(yǎng)與光照培養(yǎng)(8h/d,30001x)相結(jié)合交替進(jìn)行全程的培養(yǎng)，溫度控制在25-28℃范圍。濕度在組織培養(yǎng)中不需特意地調(diào)整，因為培養(yǎng)容器中的相對濕度幾乎達(dá)到100%，因此，如何控制人工培養(yǎng)環(huán)境的重點和難點在于培養(yǎng)基的選擇和配制。
1.培養(yǎng)基
植物培養(yǎng)基是從無土栽培的營養(yǎng)液發(fā)展而來的，在某種意義上可理解為模擬土壤。最初的培養(yǎng)基是馬鈴薯浸出液，隨著植物生理學(xué)和生物化學(xué)研究的深入，培養(yǎng)基的構(gòu)成越來越復(fù)雜，成分越來越多。
當(dāng)瓊脂、明膠支持物的發(fā)現(xiàn)并且應(yīng)用到培養(yǎng)基中時，固體培養(yǎng)基隨之誕生。固體培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)基中常用的一種培養(yǎng)基類型。不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5范圍，一般培養(yǎng)基pH控制在5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)可以調(diào)整滲透壓。通常1-2個大氣壓可促進(jìn)植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現(xiàn)生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。無論培養(yǎng)目標(biāo)設(shè)計是針對細(xì)胞生長還是針對代謝產(chǎn)物的積累，其培養(yǎng)基主要由碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)鹽、植物生長激素、有機(jī)酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。
(1)碳源蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前兩者差。其他的碳水化合物不適合作為單一的碳源。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可增加培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物量。
(2)有機(jī)氮源通常采用的有機(jī)氮源有蛋白質(zhì)水解物(包括酪蛋白質(zhì)水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有機(jī)氮源對細(xì)胞的初級培養(yǎng)的早期生長階段有利。L-谷氨酰胺可代替或補(bǔ)充某種蛋白質(zhì)水解物。
(3)無機(jī)鹽類大量元素和微量元素通常使用無機(jī)鹽代替，鐵鹽通常以鰲合鐵的形式出現(xiàn)。對于不同的培養(yǎng)形式，無機(jī)鹽的最佳濃度是不相同的。通常在培養(yǎng)基中含大量元素的無機(jī)鹽濃度控制在25mmol/L左右。硝酸鹽濃度一般采用25-40mmol/L，雖然硝酸鹽可以單獨成為無機(jī)氮源，但是加入銨鹽對細(xì)胞生長有利。如果添加一些琥珀酸或其他有機(jī)酸，銨鹽也能單獨成為氮源。培養(yǎng)基中必須添加鉀元素，其濃度為20mmol/L。磷、鎂、鈣和硫等微量元素的濃度在1-3mmol/L之間。
(4)植物生長激素大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長激素。植物激素在組織培養(yǎng)中具有無可動搖的核心地位，包括五大類，即生長素類、細(xì)胞分裂素類、赤霉素、乙烯類和生長抑制素類。在植物組織培養(yǎng)中常用的是生長素和細(xì)胞分裂素。分裂素和生長素通常一起使用，促使細(xì)胞分裂、生長。生長素在植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中可促使根的形成，有效和常用的有吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸，分裂素通常是腺嘌呤衍生物。
(5)有機(jī)酸加入丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸，能夠保證植物細(xì)胞在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基上生長，并且耐受鉀鹽的能力至少提高到10mmol/L。三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，同樣能提高低接種量的細(xì)胞和原生質(zhì)體的生長。
(6)復(fù)合物質(zhì)通常作為細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)劑，如酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前這些物質(zhì)已被已知成分的營養(yǎng)物質(zhì)所替代。在許多例子中還發(fā)現(xiàn)，有些抽提液對細(xì)胞有毒性。目前仍在廣泛使用的是椰子汁，在培養(yǎng)基中濃度是1-15mmol/L。
2.培養(yǎng)器皿
培養(yǎng)器皿是強(qiáng)調(diào)植物組織細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)，有試管、三角燒瓶、罐頭瓶、培養(yǎng)皿、扁身培養(yǎng)瓶、凹面載玻片、L型管和T型管等種類。
3.培養(yǎng)外環(huán)境
植物組織細(xì)胞培養(yǎng)需要光照、溫度、濕度等條件，滿足此類條件的培養(yǎng)箱是光照培養(yǎng)箱、大型的人工氣候箱、人工氣候室或植物生物反應(yīng)器。
三、動物細(xì)胞培養(yǎng)
(一)培養(yǎng)類型
1.依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞來源動物分類
分為無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)和脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)。
(1)無脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)指來源于多孔動物門、腔腸動物門、環(huán)節(jié)動物門、節(jié)肢動物門、軟體動物門和棘皮動物門的細(xì)胞培養(yǎng)。
無脊椎動物的細(xì)胞培養(yǎng)研究晚于哺乳動物，由于無脊椎動物細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能以及營養(yǎng)需求等方面的特殊性，其細(xì)胞培養(yǎng)多數(shù)停留在原代培養(yǎng)和有限細(xì)胞系水平上。
節(jié)肢動物門可分為3個亞門7個綱，其中的甲殼綱、蛛形綱、多足綱、昆蟲綱的種類多，分布廣，某些種類可供藥用，主要代表有蝦、蟹、昆蟲。從1961年至今，已建立昆蟲細(xì)胞系800余株。
(2)脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)這些脊椎動物從低級到高級包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類。
脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)開展較早，細(xì)胞系建立比較完善。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)研究起步早，研究較多，其生物學(xué)特性更接近于人體天然產(chǎn)物，是目前生物技術(shù)產(chǎn)品研究開發(fā)的重點。
20世紀(jì)80年代WHO明確了哺乳動物傳代細(xì)胞可用于生物制品生產(chǎn)以后，該領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)在生物技術(shù)藥物的研發(fā)中獲得了長足的發(fā)展。據(jù)文獻(xiàn)報道，已批準(zhǔn)上市的生物技術(shù)藥物中70%是由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的。
2.依據(jù)細(xì)胞生長特性分類
一般分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，參考任務(wù)三十一。
3.依據(jù)培養(yǎng)目的分類
原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、克隆化培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)等。詳細(xì)內(nèi)容和操作方法參考任務(wù)三十三。
(二)培養(yǎng)條件
1.培養(yǎng)基
常用的有含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，一般是合成培養(yǎng)基，有各種型別的商品培養(yǎng)基供應(yīng)，如干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。含血清培養(yǎng)基通常使用胎牛血清、新生牛血清或小牛血清，一般添加量為5%-20%。
2.培養(yǎng)器皿
常用培養(yǎng)器皿包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)方瓶、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板等種類，具體內(nèi)容可閱讀任務(wù)十九和任務(wù)二十。
3.培養(yǎng)儀器
開放性的培養(yǎng)使用專業(yè)的CO2培養(yǎng)箱，為動物細(xì)胞的生長提供溫度、濕度與pH保證，其中，CO2濃度的恒定對穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH至關(guān)重要。
除常用的CO2培養(yǎng)箱以外，生產(chǎn)中還需要動物細(xì)胞生物反應(yīng)器、細(xì)胞工廠或滾瓶機(jī)等儀器或大型設(shè)備。
4.鏡檢儀器
倒置生物顯微鏡是*的鏡檢儀器，用于觀察培養(yǎng)物的生長狀況，檢查是否有微生物污染，初步判斷是何種細(xì)胞型微生物污染。
四、微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞與動物細(xì)胞在培養(yǎng)上的主要區(qū)別
在生物技術(shù)中，人們已經(jīng)利用細(xì)菌、絲狀真菌的大量培養(yǎng)來生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等產(chǎn)物，但是很多有重要價值的生物物質(zhì)，如毒素、疫苗、干擾素、單克隆抗體、色素、香味物質(zhì)等，必須借助于動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)來制備。
如果對微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞在培養(yǎng)上的異同點有一定的了解，將幫助學(xué)習(xí)者更好地掌握動物細(xì)胞的基本條件和要求，為哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)建立一定的理論基礎(chǔ)。
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