概述

體內(nèi)細胞不斷受到多種微環(huán)境對細胞功能的機械刺激的調(diào)節(jié)。雖然前人已經(jīng)建立了二維細胞對機械刺激的反應(yīng)模型，但這些方法缺乏相關(guān)性，因為生理細胞微環(huán)境是三維的。此外，現(xiàn)有的用于研究細胞對三維機械線索的反應(yīng)的平臺要么提供低通量，涉及復(fù)雜的制造，要么不允許對多個線索進行組合分析?？紤]到這一點，提出了一種可拉伸的高通量(HT)三維細胞微陣列平臺，該平臺可以將動態(tài)機械應(yīng)變應(yīng)用于封裝在排列的三維微凝膠中的細胞。該平臺使用生物打印技術(shù)，在周期性拉伸的彈性復(fù)合基底上打印含細胞的甲基丙烯酸明膠(GelMA)微凝膠陣列。所開發(fā)的平臺具有高度的生物相容性，并將所應(yīng)用的細胞從拉伸的底物轉(zhuǎn)移到細胞中。HT分析用于分析整個打印微凝膠陣列的細胞機械反應(yīng)。并對不同的細胞行為進行了組合分析。

1，介紹

體內(nèi)細胞不斷受到多種微環(huán)境刺激，包括生化信號、生物力學(xué)場、細胞外基質(zhì)(ECM)或底物剛度，以及細胞相互作用。細胞的命運、功能和反應(yīng)是受到所有這些微環(huán)境線索對細胞的聯(lián)合效應(yīng)的高度調(diào)節(jié)。細胞對單個微環(huán)境因子的反應(yīng)已被各種研究很好地描述出來。然而，這些因素之間存在相互作用（同時調(diào)節(jié)細胞功能），因此評估細胞對多種微環(huán)境線索的協(xié)同效應(yīng)的反應(yīng)將受益于組合和高通量(HT)方法。

細胞微陣列作為HT平臺之一，允許對多種微環(huán)境信號的細胞行為進行快速、多重的研究。大多數(shù)平臺主要集中在篩選可溶性生化因子和ECM蛋白，只有少數(shù)存在篩選機械刺激，這中機械刺激是非常重要的，因為細胞在體內(nèi)意義和響應(yīng)各種機械刺激通過機械轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，在血管系統(tǒng)中，內(nèi)皮細胞同時經(jīng)歷剪切應(yīng)力和剪切應(yīng)變，平滑肌細胞同時經(jīng)歷周向拉伸拉伸和壓縮應(yīng)變。此外，心臟和肺中的細胞暴露在拉伸應(yīng)力和應(yīng)變下，而骨和軟骨組織中的細胞則受到壓縮應(yīng)力-應(yīng)變的影響。

一些用于篩選細胞機械反應(yīng)的細胞微陣列平臺已經(jīng)被開發(fā)出來，認(rèn)識到細胞機械刺激在調(diào)節(jié)許多組織的發(fā)育和病理條件中的重要性。這些平臺的初版本能夠評估2D細胞培養(yǎng)的機械反應(yīng)。然而，這種方法缺乏生理相關(guān)性，因為3D的細胞行為與2D的*不同。由于這個原因，我們開發(fā)了能夠為細胞創(chuàng)造3D環(huán)境的平臺。功能水凝膠由于具有高度的生物相容性和支持細胞生長，已被廣泛應(yīng)用于組織工程應(yīng)用。3D微環(huán)境是通過將細胞封裝在功能性水凝膠支架中，并將其作為為陣列，然后在培養(yǎng)過程中引入刺激。然而，目前只有少數(shù)平臺證明了擁有篩選3D細胞對機械刺激的反應(yīng)的能力。Moraes等人設(shè)計了一個應(yīng)用不同壓力到凝膠陣列的微流控平臺。類似地，Liu等人開發(fā)了一種微制造平臺，通過對充滿細胞的聚乙二醇水凝膠陣列施加動態(tài)拉伸應(yīng)變，可以對細胞進行三維機械刺激。近，Li等人展示了一種陣列平臺，可以磁性驅(qū)動暴露在極限靜態(tài)拉伸應(yīng)變下的細胞內(nèi)甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)水凝膠。盡管他們在評估3D細胞對機械應(yīng)力和應(yīng)變的反應(yīng)方面采用了創(chuàng)新的方法，但這不允許篩選細胞對其他微環(huán)境刺激的綜合反應(yīng)，認(rèn)為這是一個低通量系統(tǒng)。Seo等人報道了一種可相互連接的生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器允許HT篩選連續(xù)介質(zhì)灌注下的凝膠凝膠水凝膠成分和動態(tài)壓縮應(yīng)變對干細胞成骨分化的組合效應(yīng)。雖然這個平臺允許HT研究多種線索對細胞的聯(lián)合影響，但它涉及到復(fù)雜而費力的制造過程。此外，帶圖案的細胞式水凝膠是毫米級的，因此需要大量的水凝膠。此外，本研究的結(jié)果顯示，干細胞的成骨分化增強，沒有顯示出任何其他細胞向拉伸方向的行為，這是外部機械刺激作用細胞時常見的觀察。

在本文中，我們報道了一個可伸縮的三維細胞微陣列平臺，具有簡單的制造步驟和提高的吞吐量容量。所開發(fā)的平臺是由三維生物打印成纖維細胞負(fù)載的GelMA微凝膠陣列結(jié)合在彈性復(fù)合膜基質(zhì)上組成。使用定制的單軸動態(tài)拉伸器對平臺進行動態(tài)單軸拉伸，以研究細胞對機械應(yīng)變的響應(yīng)。研究了該平臺的生物相容性因素，如細胞活力、擴散和增殖等。作為概念的證明，與非拉伸對照組相比，使用細胞成像技術(shù)表征了細胞對動態(tài)機械拉伸的反應(yīng)。在開發(fā)的平臺上打印不同濃度的成纖維細胞GelMA微凝膠，對不同細胞微環(huán)境對機械刺激進行組合分析。在對照組和拉伸組中，分析了單個水凝膠濃度下的細胞擴散和取向?？缮炜s微陣列平臺使細胞以HT方式機械刺激，也促進了細胞機械反應(yīng)的組合篩選。該平臺還可以擴大規(guī)模，引入廣泛的細胞外線索，并以HT的方式篩選細胞反應(yīng)和3D組織的形成。我們相信，所開發(fā)的平臺將為篩選各種生物材料參數(shù)提供一個很有前途的解決方案，用于細胞生長和調(diào)節(jié)細胞功能（特別是干細胞分化），以模擬更現(xiàn)實的生理環(huán)境。

2.平臺制備（略）

3.不同濃度和硬度細胞微陣列打印和培養(yǎng)（略）

4.拉伸測試（略）

5實驗結(jié)果分析

6 結(jié)論

動態(tài)應(yīng)變響應(yīng)細胞排列的機制

一些細胞類型，特別是收縮細胞(包括成纖維細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和人間充質(zhì)干細胞(hMSCs))，已經(jīng)證明能對外部動態(tài)刺激作出反應(yīng)。一般來說，當(dāng)暴露于靜態(tài)或動態(tài)拉伸時，3D水凝膠中的細胞與拉伸軸對齊。當(dāng)我們的平臺以1hz的頻率以10%的應(yīng)變率拉伸3天時，6%GelMA芯片內(nèi)的細胞也平行于拉伸方向，這一結(jié)果與現(xiàn)有文獻一致。平行細胞與應(yīng)變方向（3D水凝膠結(jié)構(gòu)）的機制尚不*了解。然而，基于現(xiàn)有的理論，在拉伸的6%GelMA微凝膠的核心區(qū)域的平行細胞對齊可以在單細胞和多細胞水平上進行解釋。

在單個細胞水平上的細胞對齊

初，細胞通過接觸引導(dǎo)進行伸長和排列，這種現(xiàn)象是指細胞和肌動蛋白絲（細胞內(nèi)的應(yīng)力纖維）的取向主要由襯底的幾何線索或襯底內(nèi)的纖維決定(在3D水凝膠/靜電紡絲纖維的情況下)。ECM纖維初與循環(huán)拉伸方向?qū)R，通過接觸引導(dǎo)機制促進細胞沿著纖維的方向?qū)R。先前的研究表明，軟膠原原纖維傾向于沿著應(yīng)變施加的方向排列。因此，當(dāng)將外部應(yīng)變施加于我們的GelMA微凝膠時，微凝膠纖維可能已經(jīng)向拉伸方向排列，這反過來可能要求細胞向類似的方向排列。

由于交聯(lián)微凝膠陣列中的GelMA纖維初是隨機的，并且沒有暴露在任何動態(tài)機械拉伸條件下，細胞排列也是隨機的，這也是一種接觸引導(dǎo)現(xiàn)象。使用掃描電鏡可以看到纖維的排列；然而，凍干過程可能會影響微凝膠，凍干平臺的處理并不容易。

在3D水凝膠中，細胞不斷地改變其形狀，并與微環(huán)境機械地相互作用，以遷移或響應(yīng)外力。這種細胞與其微環(huán)境相互作用的動態(tài)過程被稱為黏合斑(FA)成熟，在此過程中，細胞不斷地重塑其細胞骨架、周圍的ECM網(wǎng)絡(luò)，并通過FA（細胞機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要樞紐）與ECM的連接。這一過程也有助于細胞通過ECM纖維網(wǎng)絡(luò)的遷移。一般來說，細胞對周圍的水凝膠纖維網(wǎng)絡(luò)施加收縮力，并在纖維拉長時收縮纖維。收縮力在基質(zhì)內(nèi)引起局部張力力，與細胞的收縮力保持平衡，從而保持平衡。

當(dāng)一個外部動態(tài)應(yīng)變被施加到一個富含細胞的水凝膠上時，它會在整個水凝膠中產(chǎn)生一個整體應(yīng)變，從而導(dǎo)致纖維中的張力增加。為了保持系統(tǒng)平衡，細胞通過肌動球蛋白收縮過程增加收縮力。細胞收縮力的增加增加了細胞內(nèi)的張力，并產(chǎn)生了成束的應(yīng)力纖維（肌動蛋白絲），促進其FA成熟和向拉伸方向延伸/偽足的形成。此外，細胞的高收縮性導(dǎo)致水凝膠纖維的局部緊實應(yīng)變增加；然而，細胞傾向于避免任何壓力/應(yīng)變。

6%GelMA微陣列的楊氏模量為6.6 kPa，通常被認(rèn)為是柔順性水凝膠。由于成纖維細胞本質(zhì)上具有高度收縮性，它促進了FA成熟，并沿拉伸方向產(chǎn)生大量應(yīng)力纖維。它還會產(chǎn)生較高的局部橫向壓實應(yīng)變（由于6%GelMA的順應(yīng)性），其大小大于施加的應(yīng)變。一方面避免局部應(yīng)變，另一方面FA成熟過程的增加會導(dǎo)致6%GelMA微陣列中的成纖維細胞平行于拉伸方向重新定向。

在多細胞水平上的細胞對齊

上述理論描述了單個成纖維細胞如何沿著拉伸方向排列。然而，多細胞水平上的細胞排列分為三個階段。先，單個細胞自身與拉伸方向平行排列，然后細胞在平行的方向上彼此排列。隨后，細胞相互關(guān)聯(lián)，形成一個與拉伸軸平行的繩狀結(jié)構(gòu)。細胞之間的緊密結(jié)合是高收縮性、FA成熟和避脅變性的結(jié)果。這種繩狀結(jié)構(gòu)使細胞看起來更細長，這可能是我們觀察到包裹在6%拉伸GelMA微凝膠陣列中的成纖維細胞比6%對照GelMA微陣列中隨機排列的細胞具有更高伸長程度的原因（圖S2B，支持信息）。另一個重要的觀察結(jié)果是，繩狀結(jié)構(gòu)主要出現(xiàn)在相對濃度較小的GelMA微凝膠中（圖S2A-i，支持信息）。這是因為當(dāng)細胞密度很高時，細胞間相互作用的幾率很高所有方向都會發(fā)生粘附，防止形成清晰的繩狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)細胞間的粘附力更強時，細胞有可能形成網(wǎng)狀圖案。因此，在未來，在生物打印過程中控制細胞密度可以改善整個拉伸GelMA微陣列中繩狀結(jié)構(gòu)的形成。

細胞遷移能力與隨機水凝膠纖維內(nèi)的排列

細胞與拉伸方向的排列需要細胞在水凝膠內(nèi)遷移。因此，細胞遷移是使細胞朝向施加應(yīng)變方向重新定向的主要因素之一。細胞在3D水凝膠中的遷移可以用吊索短遷移（SSM）理論來解釋。如前所述，成纖維細胞通過接觸導(dǎo)向機制沿著水凝膠纖維伸出并極化。在此過程中，細胞經(jīng)歷肌動球蛋白收縮，并招募附近的水凝膠纖維來儲存其彈性應(yīng)變能。當(dāng)施加外部應(yīng)變時，其超過纖維張力，從而導(dǎo)致FA失效或接觸細胞后緣。隨后，纖維發(fā)生反沖，在此過程中，儲存的彈性能被釋放并轉(zhuǎn)移到細胞中，使其朝拉伸方向移動。細胞的SSM主要在排列的纖維中觀察到，而不是在隨機纖維中觀察到。因此，細胞重新定向可能是這兩種理論的協(xié)同效應(yīng)——水凝膠纖維向拉伸方向排列、避脅變性以及由于高肌動球蛋白收縮性而導(dǎo)致的更強ECM成熟。

沿GelMA微凝膠邊界的周向細胞排列

控制細胞重定向的其他因素是應(yīng)變率、頻率、拉伸條件的持續(xù)時間和水凝膠的幾何形狀。從我們的結(jié)果來看，主要的重定向只觀察到在GelMA微凝膠的核心區(qū)域；然而，細胞沿著其邊界呈圓周排列。幾何效應(yīng)和施加的拉伸應(yīng)變之間的競爭可能是導(dǎo)致核心和外圍區(qū)域的細胞排列不同的原因。在GelMA微凝膠的邊界上，幾何效應(yīng)(來自半球形的GelMA微凝膠)可以主導(dǎo)施加的拉伸應(yīng)變，導(dǎo)致細胞沿周向?qū)R。同樣，在核心區(qū)域，拉伸應(yīng)變主導(dǎo)了幾何效應(yīng)，并重新定向了平行于應(yīng)變的細胞。

不同剛度微環(huán)境中的離散細胞對齊

SSM理論的另一個重要結(jié)果是，細胞遷移的程度高度依賴于水凝膠基質(zhì)的剛度。

此外，水凝膠剛度影響水凝膠內(nèi)水凝膠纖維收縮、細胞收縮性、FA成熟度和橫向壓縮應(yīng)變的水平，這就提出了一個問題，即當(dāng)細胞封裝在不同硬度的微環(huán)境水凝膠中循環(huán)拉伸時會如何反應(yīng)。為了檢查水凝膠微環(huán)境剛度和循環(huán)應(yīng)變的組合效應(yīng)，我們將6%、8.5%和11%的GelMA微凝膠打印在相同的復(fù)合膜基底上，然后以1Hz頻率施加10%的應(yīng)變，持續(xù)三天。

由于我們遵循GelMA合成的標(biāo)準(zhǔn)方案，且甲基丙烯酸化程度相似，因此我們沒有測試水凝膠的降解性和溶脹率。許多以前的研究都很好地描述了這一點。由于我們的GelMA的甲基丙烯酸化率很高，約為91%，由于交聯(lián)程度較高，我們預(yù)計GelMA的降解速度比之前研究中報告的要慢。在實驗過程中或?qū)嶒灲Y(jié)束時，我們沒有觀察到打印的含有細胞的GelMA微凝膠的大小和形狀有任何顯著變化。水凝膠的可降解性總是與其剛度成反比。細胞在水凝膠內(nèi)附著和增殖，形成3D細胞網(wǎng)絡(luò)，從而降解水凝膠。細胞附著和伸長的能力取決于水凝膠的硬度。在較軟的水凝膠中，成纖維細胞可以通過在3D環(huán)境中輕松牽引水凝膠纖維來牽引和拉長水凝膠纖維，從而局部降解水凝膠纖維。由于細胞不能在致密的微凝膠基質(zhì)中伸長和增殖，因此細胞在堅硬的水凝膠中保持圓形，從而降低水凝膠的降解率。同樣，水凝膠的剛度也會影響水凝膠的溶脹率。水凝膠濃度越高，水凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)密度越高，這限制了水的滲透速度和滲透量，進而減緩了水凝膠的降解。

基于上述假設(shè)，我們希望觀察細胞排列趨勢的差異。正如預(yù)測的那樣，隨著GelMA濃度的增加，我們觀察到水凝膠的機械強度增加，孔徑減小。幾何效應(yīng)在微凝膠的周邊區(qū)域占主導(dǎo)地位，與GelMA的濃度和硬度無關(guān)，因此在所有三種情況下，細胞都沿圓周方向排列。然而，我們分別在6%、8.5%和11%拉伸富含細胞的GelMA微陣列的核心區(qū)域觀察到平行、混合和垂直細胞取向?；谏鲜黾僭O(shè)，細胞取向的這些差異可以再次得到解釋：隨著GelMA硬度的增加，細胞的收縮力不足以牽引和拉伸更硬的纖維。因此，由于細胞產(chǎn)生的收縮力較小，纖維中的張力較小，這顯著降低了微凝膠中的局部橫向壓縮應(yīng)變。此外，較硬的GelMA不會發(fā)生大量變形，導(dǎo)致壓縮應(yīng)力和應(yīng)變沿著外部施加應(yīng)變的方向發(fā)展。

在拉伸方向上增加的壓縮應(yīng)力和應(yīng)變會導(dǎo)致細胞避開拉伸方向，因此在8.5%（中等硬度）和11%GelMA（高硬度）微凝膠的情況下，細胞會在混合和垂直方向上對齊。

細胞遷移能力也受到水凝膠硬度的影響。根據(jù)SSM理論，較軟的水凝膠（6 kPa）中的細胞遷移速度比較硬的水凝膠快五倍（我們6%的凝膠硬度為6.6 kPa）。較硬纖維中缺乏張力會減少儲存的彈性能，從而降低細胞遷移率。當(dāng)復(fù)合膜以10%的應(yīng)變拉伸時，我們還模擬了具有不同壓縮楊氏模量的GelMA微凝膠中的應(yīng)力分布。隨著楊氏模量的增加，我們觀察到微凝膠表面頂部沿拉伸方向和徑向的應(yīng)力水平增加（圖S3，支持信息）。因此，模擬結(jié)果與我們關(guān)于細胞排列的假設(shè)一致。

除了細胞重新定向外，周期性拉伸使細胞能夠形成高度接近體內(nèi)條件的結(jié)構(gòu)，并提高其分化能力和功能。這可能是觀察到大量細胞在硬水凝膠中伸長和重新定向（拉伸時）的原因，這表明細胞經(jīng)歷了應(yīng)變。然而，未拉伸的更硬的GelMA微凝膠（8.5%和11%）內(nèi)的細胞沒有太長。這些結(jié)果也與現(xiàn)有文獻[32]一致，表明細胞不會在較硬的3D水凝膠中附著、伸長和增殖。一種可能的解釋是，溶解度因子的擴散速率受到更硬的水凝膠中較小孔徑的高度影響。

因此，在較硬的非拉伸微凝膠周圍的細胞似乎伸長，因為它們具有大的擴散。細胞保持圓形的另一個原因可能是它們無法降解較硬的微凝膠基質(zhì)。此外，剛性微凝膠纖維的也很難讓細胞附著和伸長。然而，我們推測，動態(tài)刺激（在我們的例子中是循環(huán)拉伸）增強了更硬水凝膠內(nèi)的細胞擴散，這與其他類似研究一致。進一步研究細胞功能，如機械傳導(dǎo)和細胞間信號，以及拉伸和控制富含細胞的GelMA微凝膠陣列，將有助于確定存在機械刺激時水凝膠微環(huán)境特性對細胞行為的影響。

本實驗拉伸平臺和不同硬度的凝膠由MACH-1多功能微觀力學(xué)測試儀進行自動高通量壓痕測試得到楊氏模量。極大的方便了科學(xué)實驗的進行和分析。

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