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J BIOMED OPT:用于小鼠視網(wǎng)膜體內(nèi)成像的自適應(yīng)光學(xué)OCT

來源:北京心聯(lián)光電科技有限公司   2022年04月29日 10:27  
視覺研究中,視網(wǎng)膜疾病的小動(dòng)物模型非常重要,無創(chuàng)高分辨率的體內(nèi)鼠視網(wǎng)膜成像是該領(lǐng)域應(yīng)用的重要工具。加拿大研究人員Yifan Jian等介紹了一種用于小鼠體內(nèi)視網(wǎng)膜高分辨率成像的定制傅里葉域光學(xué)相干斷層成像(FD-OCT)設(shè)備。為了克服小鼠眼畸變,在折射FD-OCT系統(tǒng)的采樣臂中引入一個(gè)商用自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)。使用折射抵消透鏡減少了角膜的低階像差和鏡面反射。文章還描述了一種用于修正小鼠眼殘余波前像差的自適應(yīng)光學(xué)(adaptive optics, AO)系統(tǒng)的性能,展示了有無AO校正的活體內(nèi)AO FD-OCT圖像。體內(nèi)成像結(jié)果表明視網(wǎng)膜圖像中毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維束的亮度和對(duì)比度得到了改善。文章以“Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinalimaging”為題發(fā)表于J BIOMED OPT。
 
背景
 
人類疾病的小動(dòng)物模型是現(xiàn)代視覺研究的重要組成部分。嚙齒動(dòng)物(如小鼠和大鼠)通常用于開發(fā)對(duì)抗致盲疾病的新療法。為了更好地觀察細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)、了解活體視網(wǎng)膜的分子過程,需要對(duì)嚙齒動(dòng)物眼睛進(jìn)行高分辨率視網(wǎng)膜成像。免疫組織學(xué)等技術(shù)可作為視網(wǎng)膜研究的金標(biāo)準(zhǔn),但只能研究單個(gè)時(shí)間點(diǎn),還可能需要使用許多動(dòng)物。而無創(chuàng)成像使研究單個(gè)動(dòng)物在治療過程中的動(dòng)態(tài)過程和反應(yīng)成為可能。
 
對(duì)于活體內(nèi)眼成像,獲得細(xì)胞級(jí)分辨率通常需要大瞳孔及自適應(yīng)光學(xué)(AO)實(shí)現(xiàn)。AO能夠校正眼睛折射表面引起的像差,實(shí)現(xiàn)衍射極限的橫向分辨率。使用AO結(jié)合眼底攝影、OCT和共焦掃描激光眼底鏡,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人感光器馬賽克的可視化。已知視力良好的年輕健康志愿者在適當(dāng)瞳孔大小(3-4mm以下),不使用OA的情況下,可觀察到從中央凹偏心2°的錐狀馬賽克。然而接近中央凹處的錐狀或棒狀感光器密度要高得多,因此要想提高分辨率并使這些結(jié)構(gòu)可視化,就需要大瞳孔尺寸和AO校正。
 
小鼠眼睛大小約為人類的1/8,但其數(shù)值孔徑(NA)是人類的2倍以上。而光學(xué)像差對(duì)圖像質(zhì)量的影響隨著NA的增加而增加,這阻礙了小鼠體內(nèi)高分辨率成像。為此科學(xué)家們做了很多補(bǔ)償相差嘗試:Biss等人的AO生物顯微鏡和Alt等人用于小鼠視網(wǎng)膜活體成像的AO SLO表明,AO校正單色像差提高了圖像的亮度和分辨率;Geng等人證明當(dāng)一個(gè)引發(fā)長聚焦深度的小直徑波前信標(biāo)入射到小鼠視網(wǎng)膜上時(shí),Hartmann-Shack波前傳感器(WFS)中出現(xiàn)了一個(gè)雙斑點(diǎn),而他們最新的AO共焦掃描激光檢眼鏡(cSLO)在活體小鼠視網(wǎng)膜中shouci觀察到了光感受器馬賽克。
en face成像方式的cSLO相比,OCT的優(yōu)勢(shì)在于能夠獲得視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的橫截面圖像,這一特性使得嚙齒動(dòng)物縱向研究成為可能。除結(jié)構(gòu)信息外,OCT功能擴(kuò)展(如多普勒OCT和血流對(duì)比OCT)還能可視化血管網(wǎng)絡(luò)。
 
OCT圖像的質(zhì)量在很大程度上受焦點(diǎn)大小、掃描長度、采樣密度影響,OCT B-scan平均技術(shù)也會(huì)影響散斑(相干噪聲)的尺寸和對(duì)比度。臨床OCT平均圖像質(zhì)量的提高通常是通過斑點(diǎn)圖案的模糊來實(shí)現(xiàn),因此橫向分辨率降低了2/3或更多。
 
本研究旨在探討提高OCT對(duì)小鼠視網(wǎng)膜成像的橫向分辨率的方法。研究人員將外目標(biāo)透鏡與折射抵消眼底透鏡結(jié)合以減少小鼠眼像差,利用該技術(shù),在小鼠視網(wǎng)膜體內(nèi)成像過程中,可以通過增加NA來減小斑點(diǎn)的大小。為了確保光斑尺寸(橫向分辨率)的改善不會(huì)被因像差增加而產(chǎn)生的斑點(diǎn)模糊而抵消,將自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)集成到小鼠視網(wǎng)膜OCT成像儀中。使其能夠監(jiān)測(cè)并校正折射誤差,從而改善聚焦光斑尺寸。體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,可以觀察到橫向分辨率增加及散斑尺寸減小。
 


 

圖1 小動(dòng)物AO FD-OCT系統(tǒng)示意圖。
 
 
結(jié)果
 
將麻醉小鼠的眼睛對(duì)準(zhǔn)眼底透鏡,通過軸向平移眼底透鏡和小鼠進(jìn)行適度調(diào)焦(圖1)。由于FD-OCT和波前傳感器(WFS)使用同一光源,通過觀察B-scan調(diào)整焦平面在小鼠視網(wǎng)膜上的位置,可以監(jiān)測(cè)對(duì)WFS斑點(diǎn)的影響。圖2為來自WFS相機(jī)的代表性圖像,其中DM保持在推薦的“平坦”位置。圖2(a)數(shù)據(jù)在焦點(diǎn)未優(yōu)化時(shí)獲得,B-scan中整個(gè)視網(wǎng)膜厚度普遍明亮,波前斑點(diǎn)較大。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)波前斑點(diǎn)中有兩個(gè)峰值,與已報(bào)道結(jié)果相似。圖2(b)中的WFS數(shù)據(jù)是調(diào)整外視網(wǎng)膜上的焦點(diǎn)位置后獲得。放大視圖中,WFS點(diǎn)似乎變得更圓,并且只包含一個(gè)單峰,這對(duì)于質(zhì)心檢測(cè)和AO像差校正算法非常重要。在相應(yīng)的同時(shí)獲得的B-scan中,與圖2(a)相比,視網(wǎng)膜外層的強(qiáng)度高于視網(wǎng)膜內(nèi)層。
 


 

2 WFS相機(jī)圖像及相同位置同時(shí)獲取的相應(yīng)對(duì)數(shù)標(biāo)度B-scan。熱圖中一個(gè)WFS點(diǎn)(紅色虛線圓圈中)以較高的放大率顯示,在黑線位置提取相應(yīng)的強(qiáng)度分布。(a)具有非優(yōu)化焦點(diǎn)的WFS圖像。(b)優(yōu)化光束聚焦于視網(wǎng)膜外層獲得的WFS圖像。
 
 
圖3(b-d)為成像期間,WFS在AO校正前后記錄的均方根誤差和Zernike系數(shù)測(cè)量值。在AO校正前,將小鼠眼睛沿光軸對(duì)齊,焦點(diǎn)設(shè)置在外視網(wǎng)膜。AO校正前的均方根誤差在0.2-0.6 μm范圍內(nèi),以散焦和散光為主。激活A(yù)O校正后,均方根波前誤差降低到50 nm左右。繪制了8只小鼠(僅右眼)校正前后每個(gè)Zernike系數(shù)的平均幅度(平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差),展示系統(tǒng)性能(圖3e)。
 


 

圖3(a)用紙模在視網(wǎng)膜平面上測(cè)量系統(tǒng)殘余像差。(b)小鼠成像過程中RMS波前誤差的代表性軌跡。用AO FD-OCT成像小鼠視網(wǎng)膜時(shí),(c)AO校正前和(d)校正過程中測(cè)得的相應(yīng)Zernike系數(shù)。(e)對(duì)8只小鼠樣本測(cè)量校正前后Zernike系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的平均值。
 
 
圖4為小鼠視網(wǎng)膜定制標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT系統(tǒng)的代表性圖像,以及來自具有類似光源(軸向分辨率)的AO FD-OCT系統(tǒng)圖像。有文獻(xiàn)也描述了用于獲取這些圖像的標(biāo)準(zhǔn)橫向分辨率嚙齒動(dòng)物FD-OCT系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)。簡而言之,系統(tǒng)的高斯束腰(1∕e2)約6.5μm、焦深約308μm(足以容納小鼠視網(wǎng)膜的全部厚度)。標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像的采集和處理與AO FD-OCT系統(tǒng)圖像保持一致。圖5中的標(biāo)準(zhǔn)分辨率B-scan由1.5 mm橫向掃描長度獲得。所有主要的視網(wǎng)膜層都可以在圖像中識(shí)別,且似乎都是明亮的。黃色虛線框中的插圖由AO FD-OCT系統(tǒng)獲得,所用小鼠與標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT系統(tǒng)成像所用小鼠相同品系。插圖中,與標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像相比,AO FDOCT光束聚焦在比視網(wǎng)膜內(nèi)層更亮的視網(wǎng)膜外層。如預(yù)期,AO FD-OCT圖像中觀察到的斑點(diǎn)尺寸明顯小于標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像中的,從而增強(qiáng)了視網(wǎng)膜層的可見性。
 


 

圖4 普通嚙齒動(dòng)物OCT B-scan與高分辨率AO-OCT B-scan(AO-ON采集黃色虛線框內(nèi))的比較。圖像均來自C57BL/6J(色素沉著)小鼠,由20次運(yùn)動(dòng)校正B-scan平均產(chǎn)生。數(shù)據(jù)均采用對(duì)數(shù)強(qiáng)度標(biāo)度。AO FD-OCT插圖上看到的斑點(diǎn)尺寸較小。比例尺100μm。
 
 
為了可視化AO系統(tǒng)對(duì)B-scan的影響,在AO系統(tǒng)關(guān)閉和打開的情況下,對(duì)同一視網(wǎng)膜位置采集了幾組數(shù)據(jù),并用線性強(qiáng)度標(biāo)度顯示結(jié)果。圖5(a)為AO系統(tǒng)關(guān)閉(OFF)時(shí)的圖像(flat DM),物鏡焦點(diǎn)在外視網(wǎng)膜上。圖5(b)為AO開啟(ON)時(shí)聚焦于外視網(wǎng)膜的B-scan,圖5(c)為聚焦于內(nèi)視網(wǎng)膜的B-scan。AO校正激活(AO-ON)時(shí),B-scan更亮(圖5右)。例如當(dāng)AO被激活并聚焦在外視網(wǎng)膜時(shí),OLM的測(cè)量強(qiáng)度增加了約3倍(圖5a和b)。焦點(diǎn)偏移的效果可以通過圖5(b和c)中相應(yīng)視網(wǎng)膜層的強(qiáng)度變化來觀察。
 


 

圖5 相同偏心率下獲得的C57BL/6J(色素沉著)小鼠視網(wǎng)膜體內(nèi)OCT B-scan圖像(左),及深度-強(qiáng)度曲線(右)。(a)AO關(guān)閉時(shí)(DM flat)獲取,(b)AO激活并將焦點(diǎn)設(shè)置在外視網(wǎng)膜時(shí)獲取,(c)AO激活并通過AO軟件將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到內(nèi)視網(wǎng)膜時(shí)獲取。圖像(a)、(b)和(c)通過平均20次B-scan生成,并以線性強(qiáng)度標(biāo)度呈現(xiàn)。比例尺50μm。
 
 
激活A(yù)O系統(tǒng)后,可以通過改變AO控制軟件中的離焦量來調(diào)整焦平面位置。在小鼠視網(wǎng)膜的B-scan圖像中,可以實(shí)時(shí)觀察到焦平面位置的變化,因?yàn)榻蛊矫嫔细鲗拥牧炼蕊@著增加。從光柵掃描獲得的AO FD-OCT體積式圖中提取小鼠視網(wǎng)膜的en face圖像,垂直疊加的B-scan幀間距為0.6μm。圖6為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)、內(nèi)網(wǎng)狀層(IPL)和外網(wǎng)狀層(OPL)的代表性圖像。橫截面圖像中括號(hào)所示為聚焦層及創(chuàng)建en face圖像所需的像素范圍。在同一位置采集四組體積式數(shù)據(jù),用相同參數(shù)進(jìn)行后處理,并在相同的線性強(qiáng)度標(biāo)度上呈現(xiàn)。黃色虛線框中的圖像數(shù)據(jù)沿短軸平均,以生成右側(cè)的強(qiáng)度圖(藍(lán)色線表示AO-ON,紅色虛線表示AO-OFF)。AO激活后RNFL中神經(jīng)纖維以及IPL和OPL中毛細(xì)血管的銳度和亮度得到改善(圖7)。在AO-OFF情況下,只有OPL(圖6f)具有足夠的對(duì)比度以使得能夠與對(duì)應(yīng)的AO-ON圖像(圖6c)進(jìn)行比較,右欄的線形圖形中可觀察到毛細(xì)血管強(qiáng)度有2-3倍的增加。
 


 

圖6 用AO FD-OCT系統(tǒng)體內(nèi)獲得的小鼠視網(wǎng)膜橫截面圖像。通過改變AO控制軟件中的離焦量,將焦平面設(shè)置在視網(wǎng)膜內(nèi)部。B-scan中括號(hào)所示的軸向深度代表不同視網(wǎng)膜層的en face投影,分為AO-ON時(shí)(a-c)和AO-OFF(DM平面)時(shí)(d-f)。比例尺30μm。
 
 
圖7顯示了與圖6所示不同的動(dòng)物視網(wǎng)膜圖像??梢暬瞬煌拿?xì)血管叢層和感光層(PRL),可見強(qiáng)度和分辨率提高(視網(wǎng)膜毛細(xì)血管寬度提高)。圖7(c和g)中的綠色虛線框表示在AO打開和關(guān)閉的情況下測(cè)量幾個(gè)不同尺寸毛細(xì)血管寬度的位置。相應(yīng)的折線圖已標(biāo)準(zhǔn)化(圖7底部1、2和3)。平均而言,用AO-ON測(cè)量的毛細(xì)血管直徑比AO關(guān)閉時(shí)約窄2.5×。
 


 

圖7 用AO FD-OCT系統(tǒng)體內(nèi)獲得的小鼠視網(wǎng)膜截面和en face圖像(IPL、INL、OPL和PRL)。通過改變AO控制軟件中的離焦,在感興趣層上調(diào)整焦平面,如B-scan圖像中的紅色括號(hào)。B-scan中括號(hào)所示的軸向深度分別表示AO-ON(a-d)和AO-OFF(DM平面)(e-h)時(shí)同一位置不同視網(wǎng)膜層的en face投影的位置。底部為c和g中標(biāo)記1、2和3的位置處毛細(xì)血管圖像強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化線圖。比例尺30μm。
 
 
結(jié)論與討論
 
本文介紹了一種用于小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像的AO FD-OCT系統(tǒng),系統(tǒng)使用同一光源做成像光源和波前傳感光源。為了便于小鼠成像,使用眼底透鏡幫助對(duì)齊閉并消除角膜屈光。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠視網(wǎng)膜圖像中毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維束的亮度和對(duì)比度得到了改善。

 
自適應(yīng)光學(xué)視網(wǎng)膜成像的關(guān)鍵是精確的波前感知。對(duì)于小動(dòng)物如鼠,尤其具有挑戰(zhàn)性。本文AO FD-OCT系統(tǒng)的設(shè)計(jì)特點(diǎn)之一是使用了眼底透鏡消除空氣-角膜界面的折射,而不是用物鏡聚焦光。該方式通過組合移動(dòng)眼底透鏡和眼睛,使光可以很容易地聚焦在外視網(wǎng)膜上,從而獲得單峰高質(zhì)量的波前圖像。此外,通過使用單一光束進(jìn)行波前傳感和FD-OCT,能夠通過觀察B-scan實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成像光束聚焦的視網(wǎng)膜區(qū)域。由于被成像的眼睛與眼底晶狀體接觸,有效減少了角膜干燥和混濁。使用物鏡將光聚焦在視網(wǎng)膜上可能會(huì)使產(chǎn)生圖像平面的曲率場(chǎng)與小鼠視網(wǎng)膜的曲率不匹配,但本文不存在這個(gè)問題,因?yàn)锳O FD-OCT掃描的區(qū)域很小,如圖5-7中的B-scan圖像所示,視網(wǎng)膜表面在短距離內(nèi)是平坦的。

 
當(dāng)前的系統(tǒng)設(shè)計(jì)中,沒有使用小鼠眼球的全部NA。預(yù)計(jì)分辨率需要提高兩倍才能用高對(duì)比度來分辨橫截面圖像和en face圖像中完整的光感受器馬賽克。與cSLO不同,OCT的軸向分辨率取決于光源的帶寬;為了獲得超高的軸向分辨率,需要很寬的光譜帶寬。這給AO-OCT帶來了額外的挑戰(zhàn),因?yàn)殡S著光譜變寬,色差將開始影響光斑大小。需要進(jìn)一步詳細(xì)研究這些色差的影響,以利用小鼠眼睛的完整NA。此外,焦點(diǎn)的深度與光斑的大小相耦合;光斑尺寸較小會(huì)使焦點(diǎn)深度非常小,小于PRLs厚度。所幸OCT靈敏度非常高,離焦結(jié)構(gòu)仍然可見,但強(qiáng)度和分辨率降低。
未來研究需要提高系統(tǒng)的分辨率和聚焦深度。首先使修改屈光性AO系統(tǒng),以便通過更大的瞳孔大小對(duì)小鼠進(jìn)行成像,從而提高可實(shí)現(xiàn)的理論橫向分辨率。此外在嚙齒動(dòng)物AO-OCT系統(tǒng)中加入SLO成像通道(類似Zawadzki等人提出的人視網(wǎng)膜成像設(shè)計(jì)),將允許使用光遺傳學(xué)中的新型熒光分子探針,從小鼠體內(nèi)同時(shí)獲得結(jié)構(gòu)和潛在功能數(shù)據(jù)。另外在不犧牲AO提供的橫向分辨率的情況下,探究延長AO-FDOCT系統(tǒng)聚焦深度的方法。已知幾種可能的高NA OCT成像解決方案,包括使用動(dòng)態(tài)聚焦、實(shí)現(xiàn)貝塞爾光束成像或在AO-OCT系統(tǒng)中引入附加像差等。最終的目標(biāo)是利用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)提高橫向分辨率,實(shí)現(xiàn)體內(nèi)光感受器的細(xì)胞級(jí)分辨率成像。
 

 

參考文獻(xiàn):Jian, Y. ,  R. J. Zawadzki , and  M. V. Sarunic . "Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging." Journal of Biomedical Optics 18(2013).


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