在多肽類藥物的生產(chǎn)質(zhì)控中，氨基酸序列的測(cè)定是必不可少的檢測(cè)項(xiàng)目。對(duì)于常規(guī)組成單一的合成多肽藥物來(lái)說，氨基酸序列的分析較為簡(jiǎn)單，可通過Edman降解法或質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，其中Edman降解法被認(rèn)為更加直接可靠。但對(duì)于組成復(fù)雜的混合多肽藥物來(lái)說，比如，醋酸格拉替雷（Glatiramer acetate，簡(jiǎn)寫為GA），由于多肽組成形式復(fù)雜多變，可能具有超過一萬(wàn)億個(gè)不同序列的*多肽，如果對(duì)每種多肽成分的氨基酸序列進(jìn)行精確測(cè)定，似乎既不可能，其實(shí)也無(wú)必要，我們需要考慮新的方法對(duì)混合多肽進(jìn)行整體表征。

n 快速了解醋酸格拉替雷

醋酸格拉替雷是一種人工合成的多肽類制劑，由Glu（谷氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）和Lys（賴氨酸）四種氨基酸隨機(jī)聚合而成，原研藥由以色列藥廠TEVA研發(fā)制造（商品名Copaxone），于1996年獲美國(guó)FDA核準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥（MS），其2020年全球銷售額達(dá)到13.37億美元，2021年7月，TEVA的“醋酸格拉替雷注射液”在中國(guó)的上市申請(qǐng)獲得受理。多發(fā)性硬化癥是一種常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)包括視物模糊，感覺、運(yùn)動(dòng)異常，智能、情感等高級(jí)功能障礙，在中青年人群中多發(fā)，且有較高致殘率。醋酸格拉替雷被認(rèn)為是通過改變?cè)斐?/span>MS發(fā)病機(jī)制的免疫過程而起作用的，其療效與耐受性在臨床上獲得了十足的肯定。

醋酸格拉替雷是一種由Tyr、Lys、Glu、Ala隨機(jī)聚合而成的多肽混合物

（CAS號(hào)：147245-92-9）

醋酸格拉替雷的第一個(gè)仿制藥Glatopa （由Sandoz 公司和 Momenta公司共同開發(fā)）于2015年上市，由于原研藥的專利到期，未來(lái)將有更多的仿制藥上市。

n 醋酸格拉替雷的合成與質(zhì)量評(píng)估

在醋酸格拉替雷的生產(chǎn)過程中，通過聚合及解聚反應(yīng)，可以將其分子量控制在一個(gè)較窄的范圍（平均分子量4700～11000 Da）。生產(chǎn)工藝的改變以及所用試劑的變化都有可能使藥物的組分比例發(fā)生變化。利用Edman降解法，通過監(jiān)測(cè)N端每一個(gè)循環(huán)的4種氨基酸的組成比例以及變化趨勢(shì)，可以對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

島津解決方案

l 蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)醋酸格拉替雷進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的原理

Edman降解法是進(jìn)行N端氨基酸序列分析的經(jīng)典方法，島津以其為原理設(shè)計(jì)的全自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)序儀（以下簡(jiǎn)稱PPSQ），由液相系統(tǒng)和可執(zhí)行自動(dòng)化Edman降解反應(yīng)的主機(jī)組成，將氨基酸從多肽鏈的N端依次切割下來(lái)，通過色譜的保留時(shí)間判定氨基酸種類，結(jié)果直接可靠。PPSQ除了對(duì)N端氨基酸序列進(jìn)行定性分析外，利用液相色譜穩(wěn)定的定量能力，還可以對(duì)多肽特定循環(huán)氨基酸的摩爾生成量及組成比例進(jìn)行定量分析。

島津在售蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-51/53A

Edman降解反應(yīng)圖解

l 樣品前處理

取適量稀釋后的樣品加入經(jīng)聚凝胺處理的玻璃纖維膜上，干燥后安裝到PPSQ反應(yīng)器上進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)僅作示例，共測(cè)試了3個(gè)批次的原研藥Copaxone以及4個(gè)批次的某在研仿制藥，每個(gè)批次測(cè)試N端前6個(gè)循環(huán)。

反應(yīng)器構(gòu)造圖

l 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）N端氨基酸組成定性分析

醋酸格拉替雷原研藥每個(gè)循環(huán)均檢測(cè)到Glu、Ala、Tyr、Lys等4種氨基酸，這與藥品由Glu、Ala、Tyr、Lys等4種氨基酸隨機(jī)聚合而來(lái)，結(jié)果一致。

醋酸格拉替雷原研藥Copaxone與某在研仿制藥N端氨基酸分析色譜圖示例（1-6循環(huán)）

（黑色：原研藥Copaxone；紅色：某在研仿制藥；DTT、DMPTU、DPTU為試劑峰）

2）各循環(huán)中每種氨基酸的相對(duì)摩爾含量的分析

根據(jù)儀器自動(dòng)生成的氨基酸生成量，計(jì)算每種氨基酸的摩爾含量，例如，Glu的相對(duì)摩爾含量為：

根據(jù)氨基酸的相對(duì)摩爾含量，繪制各循環(huán)中各氨基酸生成量的趨勢(shì)圖，如下。

醋酸格拉替雷Copaxone 與某在研仿制藥N端前6個(gè)循環(huán)相對(duì)氨基酸水平分析

（縱坐標(biāo)：相對(duì)摩爾含量；橫坐標(biāo)：循環(huán)數(shù)）

3）原研藥與某在研仿制藥的比較

從趨勢(shì)圖來(lái)看，仿制藥各循環(huán)氨基酸生成量趨勢(shì)，與原研藥整體相似，但GA仿制藥-批次1的Glu的相對(duì)含量略低，GA仿制藥-批次4的各循環(huán)Tyr的相對(duì)含量略高，批次1中Glu的偏低與批次4中Tyr的偏高是否正常，需要對(duì)原研藥進(jìn)行多批次實(shí)驗(yàn)，以判斷是否超出正常范圍。GA仿制藥-批次2及GA仿制藥-批次3的Tyr生成量趨勢(shì)與其他樣品有明顯不同，提示仿制藥生產(chǎn)工藝可能存在與原研不同的地方。

結(jié) 語(yǔ)

通過醋酸格拉替雷N端各氨基酸生成量的趨勢(shì)變化的分析比較，可為仿制藥的開發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)控提供參考，醋酸格拉替雷N端相對(duì)氨基酸水平分析亦可作為醋酸格拉替雷仿制藥與原研藥一致性評(píng)價(jià)的依據(jù)。這也為我們今后分析類似混合蛋白或多肽藥物提供了參考思路。

參考文獻(xiàn)：

J. Andersona, C. Bell, et al., Demonstration of equivalence of a generic glatiramer acetate (Glatopa™), Journal of the Neurological Sciences 359 (2015) 24–34

撰稿人：頓俊玲

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