摘要

標準化細胞移植物、人工器官替代物和生化產(chǎn)品的組織和生物制造需要可控且可重復的離體組織生長培養(yǎng)物，以準確模擬體內(nèi)環(huán)境。生物反應器可以創(chuàng)建這些生理相關環(huán)境，并且可以針對特定微生物（例如細胞類型或細菌）進行定制，以優(yōu)化3D微生物和組織培養(yǎng)。但直到現(xiàn)在，尋找一種時間和成本效益高的生物反應器生產(chǎn)方案仍然是一個挑戰(zhàn)。本技術說明提出了使用由 Volumetric和BIO X6™ 提供支持的Lumen X+™設計和制造生物反應器的工作流程解決方案。首先，本技術說明詳細介紹了如何在數(shù)字光處理 (DLP) Lumen X+ 生物打印機上制造封閉式生物反應器。該技術說明還演示了BIO X6如何在生物反應器內(nèi)創(chuàng)建精確的共細胞和多細胞培養(yǎng)物以完成工作流程。

介紹

培養(yǎng)細胞和細菌讓研究人員能夠研究活材料和合成生物系統(tǒng)的體外和體內(nèi)行為，這是一種適用于微生物生物學、機械生物學、疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和生物制造等眾多領域的有用實驗方法（Kapa?czyńska, 2016; Shen, 2020; Vukasovic, 2019）。自從 Ross G. Harrison 于 1907 年開發(fā)出這項技術 (Harrison, 1907) 以來，2D 培養(yǎng)就一直在進行，它仍然是zui流行的方法之一，盡管它不能準確地模擬自然環(huán)境，因為細胞或微生物在燒瓶或培養(yǎng)皿上以單層的形式生長-可能已經(jīng)或可能沒有功能化的培養(yǎng)皿表面（Estermann，2021；Hirt，2015；Kapa?czyńska；Shen），極大地改變了微生物特性，從分化到活力再到刺激反應行為再到藥物代謝（Kapa?czyńska）。因此，二維實驗結果很難轉化為體內(nèi)應用，尤其是藥代動力學和藥效學方面的疾病研究（Hirt；Shen）。為了獲得最佳實驗性能，當今許多研究人員更喜歡 3D 培養(yǎng)方法。

最近的技術進步和生物打印機的商業(yè)可用性使得設計、快速原型制作和可靠地生產(chǎn) 3D 培養(yǎng)變得更加容易。一種流行的方法是在生物反應器中進行 3D 培養(yǎng)，或制造組織工程設備來模擬活細胞的生理環(huán)境。生物反應器因其廣泛的應用而受到關注，例如移植物（Lee，2021；Notorgiacomo，2021；Tsimbouri，2017；Vukasovic），改善球體和類器官成熟（Cho，2021；Qian，2016；Shen；Velasco，2020），培養(yǎng)干細胞（Rodrigues，2011 年）和制造工程活菌療法（Charbonneau，2020年）。生物反應器還有可能在降低成本的同時提高實驗的可重復性（Franzen，2019年），使研究人員能夠更有效地將他們的發(fā)現(xiàn)（Morgan，2018年）轉化為臨床批準的療法（Sarkar，2015 年）和活體材料植入物。鑒于這些潛力，以下工作流程演示了使用 Lumen X+ 和 BIO X6 來制造具有生物打印、載有細胞的生物材料的生物反應器。

材料和模型

模型設計

使用的生物反應器是在OnshapeCAD（計算機輔助設計）軟件的幫助下設計的，并以兩個 STL（標準鑲嵌語言）文件導出。生物反應器的兩部分包括底部和用于擠出生物打印的隔間（打印室，圖2）和用于密封設備并創(chuàng)建封閉生物反應器的蓋子。 打印室和蓋子均由直徑為 10 毫米的網(wǎng)狀底部組成，允許封裝基質和周圍介質之間進行交換。

制造

使用 Lumen X+ DLP 生物打印機和光聚合聚乙二醇二丙烯酸酯 PEGDA500 PhotoInk™ 對生物反應器進行生物打印。 之所以選擇  Lumen  X+，是因為生物反應器的微米特征尺寸需要精確的光刻（光固化）制造。 PEGDA 已廣泛用于生物學，通過細胞粘附域功能化或與 GelMA 等生物材料結合，以封裝細胞或創(chuàng)建功能化支架以指導細胞定向和增殖。 PEGDA500 PhotoInk 是一種*的生物相容性和不可降解的 PhotoInk，專為 Lumen X+ 設計。 其強大的機械性能允許創(chuàng)建具有低至 200 µm 分辨率細節(jié)的薄壁、微流體裝置和*的晶格結構，使其成為創(chuàng)建藥物輸送裝置的理想選擇。

將生物反應器的 STL 模型導入 Lumen X+ 并使用 Lumen X+ LightField 軟件以 50 µm 的更高分辨率設置進行切片。 Lumen X+ 為每個型號加載了 1 mL 的 PEGDA500 PhotoInk，并根據(jù) PEGDA500 PhotoInk 的協(xié)議設置了功率設置。 打印后，構建體被水合，然后使用塑料剃須刀片小心地從構建平臺上移除。 然后在去離子水中洗滌生物反應器以去除光吸收染料和未固化的樹脂。 最后，在使用擠出生物打印將細胞打印到打印室之前，將構建體以水合狀態(tài)儲存幾天。

圖 3. 生物反應器室的打印后清洗

光吸收染料具有無毒成分，并且在本技術說明中進行的儲存步驟是可選的。為了獲得最佳的顯微鏡條件，建議去除多余的光吸收染料。如果不需要顯微鏡，則可以在清洗后立即進行基于擠出的生物打印步驟，以去除未固化的 PhotoInk。對于載有細胞的構建體，建議使用平衡緩沖液或細胞培養(yǎng)基作為洗滌溶液。

對于進入打印室的生物打印，使用了配備標準氣動打印頭和 CELLINK Bioink 的 BIO X6。選擇一個直徑為 10 毫米、高 1 毫米的圓柱形模型，并使用 DNA Studio 軟件進行調(diào)整，最終直徑為 8  毫米，共三層。固化擠出的生物墨水后，生物反應器蓋的邊緣用  PEGDA500  覆蓋，然后將其放置在打印室的頂部以將其關閉。最后，使用 BIO X6 的 405 nm 光固化模塊密封該設備，定位在 3 cm 處以照亮支架 15 秒。密封生物反應器是可選的，打印室可以像Transwell 系統(tǒng)一樣單獨使用，也可以用于氣液界面 (ALI) 培養(yǎng)。

圖 4. 生物打印物體實物。

總結

在組織工程和細胞培養(yǎng)領域，將器官芯片和生物反應器技術相結合是更好地概括人類生理學以提高培養(yǎng)準確性和效率的關鍵因素。在本技術說明中，基于 DLP 的高分辨率 Lumen X+ 生物打印機與基于多材料擠壓的生物打印相結合，在可用作生物反應器、Transwell 系統(tǒng)或共培養(yǎng)室的腔室中創(chuàng)建了一個活支架。

 生物反應器可以放置在經(jīng)典的 24 孔板中，*或部分浸入細胞培養(yǎng)基中。多孔系統(tǒng)允許打印室內(nèi)的營養(yǎng)物質水合和循環(huán)。此外，該生物反應器可以在沒有蓋子的情況下用作經(jīng)典的 ALI 系統(tǒng)，用于皮膚組織模型的生長。

除了組織工程應用之外，還可以在生物反應器的腔室中放置其他元件。例如，可以將封裝在珠子中的細胞放入培養(yǎng)箱中，通過將系統(tǒng)置于攪拌下，例如 C.BIRD™ 系統(tǒng) (CYTENA) 進行懸浮培養(yǎng)。另一種方法是使用腔室中的一種介質和井中的一種介質來創(chuàng)建雙室配置、梯度系統(tǒng)或基于兩種溶液之間交換的動態(tài)流動。

通過在生物打印水凝膠的兩側安排細胞，然后通過腔室的孔監(jiān)測交換、通訊和定殖以進行細胞遷移/侵襲研究，共培養(yǎng)方法也很有趣。該腔室還可以用 ECM（細胞外基質）元件進行功能化以促進細胞粘附，并且可以添加趨化分子以促進遷移。此外，PEGDA500 腔室可以裝載藥理學分子以形成藥物釋放支架。