簡介
novel coronavirus的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的novel coronavirus大流行，為了理解病毒的發(fā)病機(jī)理并開發(fā)疫苗，亟需快速開發(fā)多種研究工具。檢測(cè)病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對(duì)novel coronavirus的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測(cè)有效性的重要參數(shù)。

人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗(yàn) (PRNT) 來檢測(cè)。然而，該方法使用活的、具備感染性的

病毒加入到靶細(xì)胞中，所以需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及耗時(shí)費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費(fèi)時(shí)間并且不能自動(dòng)化。此外，假病毒中和試驗(yàn) (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，但此方法需要細(xì)胞培養(yǎng)和熒光成像來測(cè)得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。

此 GeneScript cPass

novel coronavirus中和抗體檢測(cè)試劑盒采用免病毒中和測(cè)試法 (sVNT) 來克服傳統(tǒng)的病毒中和實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)。它采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示。
優(yōu)勢(shì)
• 快速、簡單的 ELISA 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)置

• 無需三級(jí)實(shí)驗(yàn)室或細(xì)胞培養(yǎng)

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蝕斑減少中和試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致

刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結(jié)合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被

的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結(jié)合將會(huì)被打破，隨后清洗，移 除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機(jī)測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)，在中和抗體存在的情況下，此信號(hào)會(huì)更低，將此信號(hào)與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的信號(hào)進(jìn)行比較，可以評(píng)估待測(cè)樣本中存在的中和抗體活性。

在 此，替代的病毒中和實(shí)驗(yàn) (sVNT) 試劑盒的數(shù)據(jù)結(jié)果，由SpectraMax 微孔板讀板機(jī)進(jìn)行檢 測(cè)、SoftMax Pro 軟件進(jìn)行分析得到。這些結(jié)果與先前使用的傳統(tǒng)假病毒中和試驗(yàn)(pVNT) 方法得到的結(jié)果密切相關(guān)，然而只需要一小部分地時(shí)間和更低的生物實(shí)驗(yàn)室安全等級(jí)限制。

材料
• GenScript cPass novel coronavirus中和抗體檢測(cè)試劑盒 (GenScriptcat. #L00847-A)，

• 10 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實(shí)中和抗體陽性，

• 3 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實(shí)中和抗體陰性，

• MultiWash+ 微孔板洗板機(jī) (Molecular Devices)

• 光吸收檢測(cè)模式用到的 Molecular Devices 酶標(biāo)儀：

• SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀

• SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀

• SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀

• SpectraMax M5e 多功能酶標(biāo)儀

方法
在實(shí)驗(yàn)開始前，試劑盒的所有組分和待測(cè)樣本可放置于室溫。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：

• 用去離子水稀釋 20x 儲(chǔ)液得到 1x wash，

• 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲(chǔ)液得到HRP-RBD 工作液。

待測(cè)樣本 和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測(cè)樣本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測(cè)樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對(duì)照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +120uL 稀釋后的待測(cè)樣品或?qū)φ掌?。此混合物?37 度孵育15 分鐘。

分別添加 100uL 的陽性對(duì)照混合物、陰性對(duì)照混合物樣品混合物至實(shí)驗(yàn)復(fù)孔中。然后封蓋，在 37 度孵育 15 分鐘。

使用 MultiWash+ 洗板機(jī)和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板，每次每孔 300 uL，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個(gè)孔中，封蓋，避光，室溫孵育 15 分鐘。與 TMB 底物孵育后，50 uL 終止

、待測(cè)溶液加入到每個(gè)孔中，立即在多款酶標(biāo)儀上測(cè)讀，光吸收波長設(shè)置為 450 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性評(píng)估看陰性對(duì)照的 OD450 值是否大于 1.0，陽性對(duì)照的值是否小于 0.3。如果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，需要重復(fù)試驗(yàn)。

各個(gè)待測(cè)樣本的百分比抑制值按如下公式計(jì)算：

表 1 的卡值被用來說明樣本的結(jié)果是陽性還是陰性，是否存在可檢測(cè)到的

novel coronavirus中和抗體。表中的卡值來源于novel coronavirus sVNT試劑盒手冊(cè)。對(duì)于不同地區(qū)和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設(shè)置卡值。

結(jié)果
使用陽性和陰性對(duì)照評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。如表 2 所示，陰性對(duì)照的 OD450 值大于 1.0，陽性對(duì)照的 OD450 值小于 0.3，

這是根據(jù) sVNT 試劑盒的質(zhì)量控制要求而定。

如方法中所描述，待測(cè)樣本和陰性對(duì)照的 OD450 值用于計(jì)算百分比抑制值。基于試劑盒手冊(cè)中一般的卡值特點(diǎn)，百分比抑

制值大于等于 30% 說明檢測(cè)到

novel coronavirus中和抗體，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測(cè)到novel coronavirus中和抗體，呈陰性。在PRNT 中和活性檢測(cè)中呈陰性的三個(gè)樣品，在 sVNT 檢測(cè)中也呈陰性。同樣地，在 PRNT 中和活性檢測(cè)中呈陽性的十個(gè)樣

品，在 sVNT 檢測(cè)中也呈陽性 ( 如表 3)。

結(jié)論
此 GenScript cPass novel coronavirus中和抗體檢測(cè)試劑盒數(shù)據(jù)來源于一組患者血清樣本，與傳統(tǒng)的、耗時(shí)費(fèi)力的 PRNT 方法獲得的數(shù)據(jù)吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程，大約 1 小時(shí)能夠完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機(jī)完成，節(jié)約了寶貴的時(shí)間。SpectraMax 讀板機(jī)和 SoftMax Pro 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠運(yùn)用實(shí)驗(yàn)特異的方案進(jìn)行分析，設(shè)置公式可以應(yīng)用于所需的計(jì)算和自動(dòng)結(jié)果輸出。