簡介
作為novel coronavirus免疫反應(yīng)的一部分，感染者體內(nèi)會產(chǎn)生病毒特異性抗體，在出現(xiàn)癥狀后的一至三周內(nèi)，這些抗體可以在血液中被檢測到。IgG 和 IgM 幾乎同時出現(xiàn)，而 IgG 在更長時間內(nèi)維持一個高水平。在血清中，由于感染病毒或接種疫苗而產(chǎn)生的可檢測到的抗體可以防范將來被novel coronavirus感染。但這些抗體持續(xù)的時間長短和提供保護的程度是有關(guān)novel coronavirus仍需密切調(diào)查的眾多問題之一。

在人體血清中，通過免疫實驗來檢測novel coronavirus抗體是增進我們了解 這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTMDx SARS-CoV-2 免疫實驗使用了帶有SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個亞基，只有當它們通過結(jié)合相互靠近時，才具有功能 ) 標記的novel coronavirus刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域(RBD) 的一個片段。當這些標記過的病毒蛋白片段與含有novel coronavirus抗體的樣品一起孵育時，他們將與抗體結(jié)合，將 SmBiT和 LgBiT 兩個亞基結(jié)合到一起，并產(chǎn)生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測試劑，在微孔板光度計上測量產(chǎn)生的熒光信號。

Lumit 實驗中，樣品的添加和測讀如圖 1 所示。沒有清洗的步驟并且一小時內(nèi)測得結(jié)果，使得這個實驗可以應(yīng)用于高通量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標儀具有超冷光電倍增管(PMT)，可以為 Lumit Dx

novel coronavirus免疫實驗提供高靈敏度的發(fā)光檢測。

優(yōu)點
• 放大高通量篩選，省去清洗步驟，

• 樣品體積僅需 15 微升，

• 一小時內(nèi)測得結(jié)果。

材料
• Lumit Dx novel coronavirus免疫實驗試劑盒 (Promega cat. #VB1080)

•

novel coronavirus陽性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)

• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)

• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)

• SpectraMax iD5 多功能酶標儀 ( 美谷分子儀器 )

方法實驗試劑的準備和微孔板的操作如下 ( 更多的細節(jié)， 請參閱Lumit Dx novel coronavirus免疫實驗技術(shù)手冊 )：

1. 制 備 1x Lumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/

EGTA 溶液中 )。

2. 來源于

novel coronavirus患者或健康受試者的 30 uL 血清樣本， 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進行三次實驗； 通常每個孔僅需 15 uL 樣品。

3. Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現(xiàn) 配 現(xiàn) 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍色蓋子 )。添加完畢后，輕微地顛倒混勻。

4. Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照、Lumit-Dx 實驗校準試劑， 解凍后放置于室溫及時使用。簡短的離心可使管壁內(nèi)容物甩至管底。

5. 按如下操作， 添加試劑至白色 96 孔板中：

• 每個孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，

• 20uL 稀釋的病人血清樣本， 三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陽性對照，三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 陰性對照，三個重復(fù)，

• 20uL Lumit-Dx 實驗校準試劑，三個重復(fù)，

6. 將微孔板封蓋，室溫孵育 20 分鐘。

7. 孵育后，制備 Lumit-Dx 檢測試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測底物 ( 灰色蓋子 )，現(xiàn)配現(xiàn)用。 輕微地顛倒混勻。

8. 60 uL 檢測試劑加入孔中，室溫孵育 3 分鐘。

9. 使用 SpectraMax iD5 讀板機測讀，如表 1 所設(shè)置。 測讀完成后，相對發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。在模板中，這些孔被分配到不同的組中，各組產(chǎn)生的表單被用于計算和顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。實驗的質(zhì)控按照試劑盒技術(shù)手冊進行評估。 Lumit-Dx 實驗校準試劑、Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照都被用于確保最合適的實驗性能。相比于 Lumit-Dx 實驗校準試劑，陽性對照必須產(chǎn)生更高的相對發(fā)光單位值，陰性對照必須產(chǎn)生更低的相對發(fā)光單位值。如果這些條件不滿足，微孔板測讀結(jié)果將是無效的。