定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的熒光差異凝膠電泳技術(shù)

要開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究，雙向電泳是你必須了解掌握的zui基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，正如普通凝膠電泳對于核酸純化。可是一提起雙向電泳，多數(shù)人還是會直皺眉頭----別搖頭擺手又嘆氣啦，今天的雙向電泳早已深入改進了，特別是其中zui熱門的熒光差異凝膠電泳技術(shù)（DIGE），因為消除了傳統(tǒng)雙向電泳的一些弊端，已經(jīng)使得好多實驗室對雙向電泳重拾信心，并逐漸得到越來越多的科學(xué)家的認同。要知道基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組分析文獻每年都穩(wěn)步增長，采用DIGE技術(shù)進行研究的科研論文的比重從2004年的不到2%猛增到2008年的19.6%呢。來吧，放下偏見，不要錯過，跟著重新認識這功能強大的DIGE吧。

前塵往事

一直備受爭議的雙向電泳何以這么不招人待見呢?長話短說。

生物樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜多樣性遠超核酸，使得單向電泳無法滿足蛋白樣品分離分析的需求。1975年O`Farrell介紹了雙向電泳技術(shù)，采用等電聚焦和SDS-PAGE在等電點和分子量兩個方向上對蛋白質(zhì)進行分離，使得原本密密麻麻都擠在一條泳道上的蛋白質(zhì)得以在另外一個方向上有效分開。這個在當(dāng)時創(chuàng)意的設(shè)計雖然被寫進了教科書中成為經(jīng)典技術(shù)，可惜在隨后的實際應(yīng)用中卻遇到種種問題。由于當(dāng)時*向電泳的基質(zhì)是采用兩性電解質(zhì)配置pH梯度膠，兩性電解質(zhì)的不穩(wěn)定性導(dǎo)致等電點聚焦結(jié)果嚴重受到實驗室條件和操作手法等偶然因素的影響，第二向電泳結(jié)果就更不用說了----即使不是差之毫厘繆之千里，這種不確定性也導(dǎo)致了雙向電泳結(jié)果可重復(fù)性差，穩(wěn)定性差。不單各實驗室之間的結(jié)果難以比較，即使同一實驗室的結(jié)果也不怎么確定。我們都知道，實驗的可重復(fù)性是實驗可信度的重要指標(biāo)，也是同行評議的重要基礎(chǔ)。這種不穩(wěn)定導(dǎo)致的爭議可想而知。用不確定的方法研究不確定的未知，會“負負得正”嗎?不可能。再加上操作和結(jié)果分析的極其復(fù)雜，難怪一提起雙向電泳，人人皺眉。

直到上世紀九十年代，安瑪西亞公司（通用電氣生命科學(xué)的前身）推出了商品化的固相pH梯度膠條，極大的提高了等電聚焦的可重復(fù)性，這才使得上不同實驗室間雙向電泳實驗結(jié)果比較成為可能。

可是雙向電泳技術(shù)，依然是不可替代的，具有其他任何分離技術(shù)*的高分辨率，可以看到相應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點和分子量信息，對于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和Isoform也可以清晰展示。因此，盡管當(dāng)時爭議不斷，一些科學(xué)家和生物技術(shù)公司依然青睞2D技術(shù)，依然不懈地針對雙向電泳的缺點而努力進行技術(shù)改良。

不比不知道

比較，是一種習(xí)慣，一種本能，也是一種學(xué)問。從學(xué)生時代“期末考試第幾名?”，到如今人人熱衷的各種的xxx排行榜，以及五花八門的比賽，從不間斷地彰顯人們對比較的熱愛。在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，比較更是一種探索求知的zui重要的手段----腫瘤組織和正常組織有什么不同?從同一細胞中分化而來的不同組織有何差異?不比不知道，經(jīng)過各種比較手段找出差異，再研究這些差異的前因后果，一直是生命科學(xué)領(lǐng)域zui常用的研究思路。核酸表達差異的研究方法包括差異顯示，芯片技術(shù)，DD-PCR等等，但核酸表達差異的研究zui終無法替代蛋白質(zhì)差異研究。比較不同樣品間蛋白質(zhì)的種類和量的差異，依然是另一個重要的研究方向。由于雙向電泳具有其他任何分離技術(shù)*的高分辨率，可以看到相應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點和分子量信息，對于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和Isoform也可以清晰展示。因而成為蛋白質(zhì)表達差異研究的重要手段。

然而，雙向電泳的膠間差異仍然很大，即使應(yīng)用現(xiàn)在很的雙向電泳分析軟件，仍然有很多蛋白質(zhì)斑點無法正確匹配。即使那些匹配的蛋白點之間也無法確定其準(zhǔn)確的定量關(guān)系。較大的系統(tǒng)誤差導(dǎo)致該技術(shù)無法有效地區(qū)分系統(tǒng)誤差和樣品間的差異，因此需要需要花費大量的時間和勞動運行重復(fù)膠以期得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

繽紛熒光照亮雙向電泳

多色熒光標(biāo)記是偉大的技術(shù)發(fā)明，正是繽紛的熒光世界使得實驗不再受困于孤獨的單色標(biāo)記，同時進行“多重Multiplex”檢測成為可能。無論是高通量測序、定量PCR，芯片，流式，細胞成像，染色體原位雜交等等領(lǐng)域，多色熒光標(biāo)記都有著極為重要的應(yīng)用（詳細請看新技術(shù)專欄）。

1997年，Unlu等發(fā)表了*篇熒光差異凝膠電泳的論文，將不同的樣品分別用不同的熒光染料進行標(biāo)記后混合在同一塊凝膠中進行雙向電泳，極大地提高了實驗結(jié)果的重復(fù)性和定量的準(zhǔn)確性。2001年，Tonge等以小鼠肝臟作為實驗材料，評價了該實驗方法，并給予了很高評價。安瑪西亞公司（現(xiàn)在的通用電氣公司）從Carnegie Mellon大學(xué)購買了這種多通路熒光技術(shù)和雙向電泳技術(shù)結(jié)合的后，全面系統(tǒng)地發(fā)展改進了熒光差異凝膠電泳技術(shù)，一如前面提及，如今的Ettan DIGE使得許多實驗室對雙向電泳重拾信心，并受到越來越多科學(xué)家認同。相比傳統(tǒng)的雙向電泳，Ettan DIGE技術(shù)究竟有哪些*的創(chuàng)新和改進使之更勝*呢?

三色熒光標(biāo)記

傳統(tǒng)的雙向電泳膠間差異大，甚至難于區(qū)分系統(tǒng)誤差還是樣品間的表達差異，難以進行蛋白質(zhì)差異研究。Ettan DIGE熒光差異凝膠電泳技術(shù)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ稍谕粔K膠上同時分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品。由于不同的熒光標(biāo)記樣品有不同的激發(fā)波長，可通過不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結(jié)果。由于有了多色熒光標(biāo)記，使得在同一塊膠中分離并分析多個樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統(tǒng)誤差，特別適合比較不同樣本間差異。Ettan DIGE還在雙色熒光的基礎(chǔ)上增加了第三色熒光標(biāo)記，作為內(nèi)標(biāo)（后面介紹）。

熒光染料種類雖多，但用于蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記的熒光染料不同于普通熒光染料，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不應(yīng)該有等電點上的改變，分子量上的改變也應(yīng)該保持zui小而且不同熒光染料導(dǎo)致的分子量的改變應(yīng)該一致。用于蛋白質(zhì)預(yù)先標(biāo)記的熒光染料分為兩類，zui小標(biāo)記和飽和標(biāo)記。其中zui小標(biāo)記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團-NHS脂，可以特異性的標(biāo)記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點不會發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標(biāo)記會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基被熒光標(biāo)記修飾，才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標(biāo)記樣品時，保證合適的蛋白質(zhì)和染料的摩爾數(shù)比例至關(guān)重要。通過調(diào)整合適的pH值、合適的染料和蛋白質(zhì)的摩爾比，可以保證每個蛋白質(zhì)分子zui多只標(biāo)記上一個染料分子，來保證蛋白質(zhì)的分子量變化zui小。

另外，采用DIGE進行蛋白質(zhì)分離后，如果需要切取蛋白質(zhì)斑點進行進一步分析，則需要注意，雖然經(jīng)熒光標(biāo)記后在電荷上未發(fā)生變化，但是由于熒光團的加入（500Da左右）使得在標(biāo)記的和未標(biāo)記蛋白之間產(chǎn)生分子量上的差異，被熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)比未標(biāo)記的蛋白質(zhì)點在第二向SDS-PAGE時會有些許遷移偏差，對于那些小分子蛋白質(zhì)來說，其熒光顯色的中心并非蛋白濃度zui高的地方，因此切取點這些蛋白質(zhì)斑點時需要考慮這個偏差。一般而言，在采用DIGE膠分析并得到相關(guān)差異蛋白質(zhì)結(jié)果后，需要運行制備膠用來進行斑點切取。

飽和標(biāo)記的熒光染料包括兩種，標(biāo)記蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基，主要用于一些來源和珍貴的微量樣品的研究中。飽和標(biāo)記可避免上述問題，但是使用成本較高。在采用飽和標(biāo)記分析蛋白質(zhì)組樣品時，必須*行染料量的滴定，以確定合適的還原劑和染料的加量，否則，在DIGE膠圖上很輕易造成水平鏈狀的點或垂直拖尾。另外，由于被標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的分子量發(fā)生了改變，飽和標(biāo)記的膠圖和銀染的膠圖有所不同。

神奇的內(nèi)標(biāo)

可能是出于節(jié)約的考慮，一些實驗“老手”常常忽略實驗參照。其實是很不好的實驗習(xí)慣。實驗設(shè)計中的參照對于實驗來說非常重要。內(nèi)標(biāo)是參照體系中的一個重要概念。Alban等詳細的闡述了內(nèi)標(biāo)的概念和意義。

Ettan DIGE技術(shù)*次在雙向電泳中引入了內(nèi)標(biāo)。DIGE的內(nèi)標(biāo)是將試驗中所有樣品取等量混合，單獨用一種熒光染料（在zui小標(biāo)記染料中通常是Cy2）標(biāo)記，和所有樣品一起電泳。這意味著所有樣品中的蛋白質(zhì)點都會有對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)。通過內(nèi)標(biāo)可以方便的對膠內(nèi)不同熒光染料標(biāo)記的樣品和膠間樣品進行歸一化定量，而且不同凝膠之間的匹配變得異常輕松。

傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)可分別在等電點和分子量兩個方向上對蛋白質(zhì)組進行分離，然而在第三個方向即定量準(zhǔn)確性上并不盡如人意。內(nèi)標(biāo)在雙向電泳中的引入，極大地提高了結(jié)果的定量準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性，有效降低了系統(tǒng)誤差，給雙向電泳增加了第三個方向，確保了實驗結(jié)果的高可信度。

實驗流程

DIGE的基本實驗線路是電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品（其中包括一個蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)）。然后將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳。電泳結(jié)果分別用3種不同的激發(fā)波長得到不同顏色的熒光信號，根據(jù)這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。由于每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標(biāo)，可避免在匹配時出現(xiàn)的誤差。進行定量分析時也不再需要依靠于膠與膠之間的重復(fù)性，可用以比較數(shù)據(jù)庫中各個膠之間的蛋白質(zhì)的量的差異。軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標(biāo)對其表達量進行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學(xué)可信度達到95%以上。

Friedman等通過采用內(nèi)標(biāo)的DIGE實驗設(shè)計對人直腸癌樣品進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)52個差異蛋白質(zhì)中，有42個是在有內(nèi)標(biāo)的實驗設(shè)計中才可能被發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白質(zhì)都是用來診斷直腸癌的潛在的生物標(biāo)記物，也可能成為治療的藥物靶標(biāo)。由于熒光標(biāo)記靈敏度很高，DIGE的靈敏度可與銀染和SYPRO Ruby 相媲美，可檢測到100～200pg 的蛋白質(zhì)，而其線形動態(tài)范圍在5個數(shù)量級左右。即使少至5μg的微量樣本也可以用Ettan DIGE進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

同樣準(zhǔn)確的結(jié)果，只要跑更少的膠

跑雙向膠始終是體力和耐力活兒，需要花費大量時間和精力的。相比傳統(tǒng)2D，DIGE可以讓你跑更少的凝膠而獲得同樣高質(zhì)量的準(zhǔn)確結(jié)果。

這首先歸功于多色熒光標(biāo)記。因為多色熒光標(biāo)記可以在同一次檢測中分析同一膠上的不同標(biāo)記樣品的熒光信息，因而可同時在一塊膠上、在相同電泳條件下同時分離2個樣品，提高了電泳膠的“利用率”，減少了實驗需要的膠的總數(shù)，也節(jié)省了操作時間和成本。由于并行電泳減少膠間差異，使得分析結(jié)果的過程也大大簡化;還可避免由于實驗方法造成的蛋白質(zhì)斑點強度的差異，比如樣品在進入膠條時會有不同程度的樣品損失等。

其次，在進行傳統(tǒng)雙向電泳實驗時，通常需要運行生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)（即重復(fù)膠）以排除樣品的個體差異和實驗的系統(tǒng)誤差。由于DIGE技術(shù)將系統(tǒng)誤差降至zui低，又增加了內(nèi)標(biāo)對不同凝膠之間進行定量的歸一化，因此采用DIGE技術(shù)，無需運行重復(fù)膠。

以一個簡單的例子，如果現(xiàn)在要研究某種藥物對小鼠肝臟蛋白質(zhì)組的影響，需要2組各4只小鼠（生物學(xué)重復(fù)），分別注射藥物及安慰劑，然后在某一時間點取肝臟抽提蛋白質(zhì)組樣品進行分析。傳統(tǒng)2D電泳需跑4塊重復(fù)膠（技術(shù)重復(fù)），總共需要跑32塊2D凝膠。采用DIGE技術(shù)無需運行重復(fù)膠，8只小鼠的肝臟蛋白質(zhì)可以分別運行在4塊凝膠上即可以得到高質(zhì)量的實驗結(jié)果。凝膠數(shù)量減少至8分之1，不單所費時間和成本大大減少，膠間差異得到了有效控制，找到真實的生物學(xué)差異的可能性也大大的提高了!實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性大幅提高，在確定的差異蛋白斑點中，假陽性結(jié)果降至zui低，相關(guān)的質(zhì)譜鑒定成本也大幅降低!zui關(guān)鍵的是，得出錯誤結(jié)論的可能性也降至zui低!（把藥物組設(shè)為A，安慰劑組設(shè)為B，小鼠的編號為1-4的話，考慮樣品的隨機化原則，正確的實驗設(shè)計應(yīng)該是如下：你算得出為什么嗎?）

整體化解決方案

誰都知道配套的產(chǎn)品用，不用考慮產(chǎn)品之間的兼容問題。對于種類繁多，樣品制備復(fù)雜的蛋白質(zhì)組研究，完善配套的工具可以使工作事半功倍。全力開發(fā)并推廣DIGE的GE公司深諳此道。在雙向電泳設(shè)備的基礎(chǔ)上，GE提供全部的DIGE系統(tǒng)組件：專門用于DIGE的熒光染料，用于DIGE凝膠成像的掃描系統(tǒng)，的Typhoon系列激光共聚焦掃描成像系統(tǒng)，用于DIGE圖像自動分析的DeCyder軟件。由于GE公司已經(jīng)購買相應(yīng)熒光染料的，你不用擔(dān)心的問題。

用于DIGE膠成像的設(shè)備包括專門用于Ettan DIGE成像的EDI成像儀和多功能激光共聚焦掃描成像儀Typhoon。熒光染料在激發(fā)和發(fā)射圖譜中有小部分重疊，可能會出現(xiàn)信號的相互干擾，因而選擇合適的掃描儀器及正確的參數(shù)設(shè)定至關(guān)重要。EDI成像儀專門用于DIGE膠成像，操作簡單，無需過多的參數(shù)設(shè)置。如果你正好有Typhoon系列掃描儀，那就不需配置EDI了，Typhoon掃描成像系統(tǒng)專門為DIGE膠掃描進行了優(yōu)化，掃描得到的膠圖可以被相應(yīng)的分析軟件直接讀取，其靈敏度可以達到銀染靈敏度的十倍，而*的動態(tài)范圍和定量的準(zhǔn)確性也為DIGE系統(tǒng)能夠定量提供了硬件支持和保證。

DeCyder軟件是整個DIGE平臺的重要組成部分，共找點的設(shè)計，的膠間匹配，采用多種統(tǒng)計學(xué)分析方法令結(jié)果分析變得簡單快速。雖然目前市場上有多種雙向電泳分析軟件宣傳可以分析DIGE凝膠，然而DeCyder軟件始終是那些期望定量和準(zhǔn)確分析的科學(xué)家的。DeCyder軟件目前已經(jīng)更新到6.5版，相比之下，其他的分析軟件都是在DeCyder分析軟件推出后，在學(xué)習(xí)和消化后更新自己的版本。正版價格貴，那也是*的。不過對于精密嚴謹?shù)膶嶒?，還是提倡正版的。

作為一個新的技術(shù)平臺，Ettan DIGE技術(shù)正逐漸被廣大科學(xué)家認可，2007年Frost&Sullivan將2007年技術(shù)創(chuàng)新獎授予了通用電氣醫(yī)療集團，以表彰其將熒光差異凝膠電泳技術(shù)引進美國蛋白電泳市場。2008年，包括DIGE平臺在內(nèi)的通用電氣的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組分離分析技術(shù)榮獲了生命科學(xué)工業(yè)成就獎。DIGE技術(shù)也不斷被應(yīng)用到很多研究領(lǐng)域，到2008年5月份，DIGE技術(shù)的應(yīng)用文獻已經(jīng)多達1100余篇，平均影響因子為5.5。包括用于鑒定新藥蛋白靶點，開發(fā)新的治療策略;可靠監(jiān)測疾病的發(fā)生過程和治療過程;鑒定生物標(biāo)記物用于早期診斷;藥物分子機理或毒性研究;理解發(fā)育過程;植物蛋白質(zhì)組學(xué)，環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)等都有很多文獻。已經(jīng)成功分析的樣品包括細胞培養(yǎng)物，植物， 真菌， 細菌，海洋生物，動物模型樣品，體液，如血液、腦脊液和唾液等，人的組織樣品,，病理切片，激光捕獲顯微切割（LCM）的組織和細胞等。

怎么樣?現(xiàn)在對DIGE感覺不一樣了吧!`