一、背景

      神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如大腦皮層、海馬、脊髓等腦組織直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些亟待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，相對于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。

     神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)是研究神經(jīng)源性疾病的發(fā)病機制、進(jìn)程的一個重要工具，能很好的、直觀的反映離體神經(jīng)元的發(fā)育狀況和生理活性，如何建立一個穩(wěn)定成熟的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系是神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外實驗研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的逐漸深入，神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)在腦損傷、神經(jīng)障礙性疾病、衰老相關(guān)神經(jīng)疾病方面得到廣泛重視和普及應(yīng)用。

二、實驗步驟

(1)75%酒精消毒孕鼠，在無菌條件下取出胎鼠，分離并切取脊髓，置于冷的無鈣、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)；

(2)解剖顯微鏡無菌條件下仔細(xì)剝離脊膜及血管；

(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，0.05%胰酶37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

(4)去掉上清，加入終止液終止消化，吹打10-15次，不能有氣泡，收集上清，剩余組織再消化一次；

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入種植液1重懸，培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁30min；

(6)收集上清，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，按6×10^5cells/孔種入六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(7)培養(yǎng)第二天，全換液更換為種植液2；

(8)培養(yǎng)第四天，半量換液加入5uM的阿糖胞苷，24h全量換液；

(9)之后每周換液兩次。

1d

7d

β-Tubulin Ⅲ

β-Tubulin Ⅲ