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數(shù)字PCR實(shí)操結(jié)果及體會(huì)的特異性！
導(dǎo)讀：多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測(cè)序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個(gè)細(xì)胞之間的差異，特別是在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平。
將細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞放在顯微鏡下觀察。表面上，它們都一樣。實(shí)際上，它們一點(diǎn)都不相同。無論是DNA或RNA的水平，還是蛋白質(zhì)或代謝物的水平，這些細(xì)胞相差甚遠(yuǎn)，而這些差異可能對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測(cè)序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個(gè)細(xì)胞之間的差異，特別是在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平。
單細(xì)胞捕獲
目前，人們通常采用三種方法來分離單細(xì)胞。一種是熒光激活細(xì)胞分選（FACS），其中帶有特定熒光標(biāo)記的細(xì)胞才會(huì)激活熒光檢測(cè)器。這些細(xì)胞隨后進(jìn)入收集板中，每個(gè)細(xì)胞占一個(gè)孔，而其余的細(xì)胞被丟棄。
據(jù)BDBiosciences的生物科學(xué)副總裁RobertBalderas介紹，F(xiàn)ACS在單細(xì)胞分離上實(shí)現(xiàn)了其他方法的控制水平，這要?dú)w功于不同顏色帶來的高分辨率。“這是一種二元的方法。如果有兩種顏色和兩種抗體，那么有四種可能性；如果是20種顏色，那么有220萬個(gè)組合，”他說。
近，Broad研究院的LeviGarraway及其同事就采用了一種簡單的方案，利用CD45的表達(dá)和細(xì)胞活力來分析人黑色素瘤中4645個(gè)腫瘤、免疫和基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組3。
BDBiosciences的款儀器，F(xiàn)ACSymphonyA5細(xì)胞分析儀，提供了50個(gè)通道的分辨率（48種顏色再加正向和側(cè)向散射），理論上有1.1萬億個(gè)組合。據(jù)Balderas介紹，目前研究人員已利用這個(gè)平臺(tái)來區(qū)分30個(gè)通道，而40色的panel應(yīng)該很快面世。
單細(xì)胞分離的另一種方法是顯微操作，它利用玻璃微針，每次捕獲一個(gè)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到目的容器中。這個(gè)過程可手動(dòng)開展，或通過自動(dòng)化系統(tǒng)開展，適合低復(fù)雜度的樣品，但略顯沉悶。
一個(gè)選擇是微流體，比如Fluidigm的C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)。與的Single-CellmRNASeqHT芯片相結(jié)合，C1可平行捕獲800個(gè)細(xì)胞，并開展RNA分離和cDNA合成。這家公司的Polaris™系統(tǒng)也具有捕獲、培養(yǎng)、刺激和制備樣品的能力，可平行處理48個(gè)細(xì)胞，從而使研究人員能夠探索單個(gè)細(xì)胞的功能。
文獻(xiàn)中也經(jīng)常報(bào)道新的微流體設(shè)計(jì)。今年1月，麻省理工學(xué)院的ScottManalis及其同事介紹了一種微流體“流體力學(xué)捕獲芯片”，能夠捕獲和培養(yǎng)細(xì)胞；之后隨著免疫細(xì)胞的生長和分裂，比較各代之間的轉(zhuǎn)錄變化1。
在分離出單個(gè)細(xì)胞后，研究人員可采用多種工具來定量基因表達(dá)水平。就目前而言，的也許是單細(xì)胞RNA-Seq，或者它的衍生形式–單核RNA-Seq，其中單個(gè)細(xì)胞核被分離出來并測(cè)序2。
下一步分析
10XGenomics公司近在BioRxiv預(yù)印本網(wǎng)站上介紹了一種特別高通量的RNA-Seq方法。它基于GemCode技術(shù)，可以對(duì)每個(gè)樣品中數(shù)萬個(gè)單細(xì)胞的3’mRNA進(jìn)行計(jì)數(shù)。這家公司用它來分析68000個(gè)外周血單核細(xì)胞，并根據(jù)其轉(zhuǎn)錄特征來分級(jí)，檢測(cè)到所有預(yù)期的細(xì)胞種類（如T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等）。
另一種流行的方法是單細(xì)胞qPCR。當(dāng)然，研究人員也經(jīng)常用RNA原位雜交及相關(guān)方法。AdvancedCellDiagnostics的醫(yī)療官RobMonroe認(rèn)為，在驗(yàn)證RNA-Seq和PCR表達(dá)分析時(shí)，RNAISH特別有用，因?yàn)樗诩?xì)節(jié)上的優(yōu)勢(shì)彌補(bǔ)了通量上的不足。
RNAISH“沒有新一代測(cè)序的通量或多重分析能力”，Monroe說。“不過你獲得的東西也同樣重要：它們能夠看到RNA在組織背景、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)背景以及周圍組織中的表達(dá)。”
AdvancedCellDiagnostics的RNAscope是一種新型的RNAISH技術(shù)。兩條相鄰的“Z探針”在特定轉(zhuǎn)錄本上雜交，為高度分支的檢測(cè)探針樹的組裝提供了支架，這實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大。Monroe表示，單次結(jié)合可作為400個(gè)探針分子的支架，從而使信號(hào)放大400倍。利用顯色試劑可拷問兩個(gè)不同的RNA目標(biāo)，而利用熒光試劑可拷問三個(gè)。
的華裔學(xué)者、哈佛大學(xué)的莊小威教授將RNAISH延伸到每個(gè)細(xì)胞中的1000個(gè)轉(zhuǎn)錄本。她的團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種名為MERFISH（多重容錯(cuò)熒光原位雜交）的方法，為每個(gè)轉(zhuǎn)錄本分配一個(gè)*的16位條形碼，然后通過一系列雜交、成像和淬滅的步驟來讀取4。
在一篇發(fā)表于《NatureMethods》的評(píng)論文章中，賓夕法尼亞大學(xué)的JimEberwine及其同事寫道，“盡管單細(xì)胞測(cè)序讓人們無比興奮，但它仍不是一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作?；炯夹g(shù)以及數(shù)據(jù)分析和解釋的改進(jìn)對(duì)精確測(cè)定很重要，同時(shí)需要大樣本量來了解單個(gè)細(xì)胞的作用”5。
其他的單細(xì)胞方法也是如此。隨著文獻(xiàn)中出現(xiàn)越來越多的改進(jìn)，相信更多的研究人員會(huì)踏上單細(xì)胞分析之路。隨之而來的，將是更多隱藏在大規(guī)模培養(yǎng)物背后的生物學(xué)秘密被揭開。
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