隨著發(fā)酵劑的商業(yè) 化 生 產(chǎn) 和 應(yīng) 用 的 迅 速 增 加 ,工業(yè)發(fā)酵的基本目標(biāo)自然轉(zhuǎn)向了以小的代價(jià)獲得大的產(chǎn)值和利潤(rùn), 而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的工程手段是針對(duì)每個(gè)特定過(guò)程建立相應(yīng)的高效發(fā)酵模式。 因此,進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn), 大規(guī)模培養(yǎng)非遺傳修飾菌和工程菌的技術(shù)和工藝就顯得日趨重要。 高密度培養(yǎng)技術(shù)( HCDC, high cell density culture) 就是滿足這一需要而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興技術(shù)。 它不僅是生產(chǎn)高質(zhì)量的濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié), 是工程菌和非工程菌能否以低成本實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素, 也是菌體和代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中必需達(dá)到的重要目標(biāo)與方向。
1.高密度培養(yǎng)概述
高密度培養(yǎng)沒(méi)有確切的定義, 是一個(gè)相對(duì)概念,指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度,使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著的提高, zui終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)率。 用以描述的單位是干細(xì)胞重量/升 ( DCW/ L) 。 廣 義 來(lái) 講 , 凡 是 細(xì) 胞 密 度 比 較 高 ,以至接近其理論值的培養(yǎng)均可稱為高密度培養(yǎng), 一般認(rèn)為其上限值為 150～ 200g ( DCW/ L) , 下限值為20～ 30g ( DCW/ L) 。實(shí)際上, 由于不同菌種 ( 或者不同菌株) 之間存在較大的差異, 所以高密度培養(yǎng)的上限值和其下限值也均有例外。 Riesenberg 曾從理論上計(jì)算了充滿整個(gè)發(fā)酵罐體積的zui高發(fā)酵菌體密度為 400g( DCW/ L) , 而 Markl H. 曾設(shè)想菌體充滿 3/ 4 發(fā)酵罐體積, 其余 1/ 4 體積是培養(yǎng)基, 按照菌體干重為濕重的 20%～ 25%計(jì)算, zui高菌體密度達(dá)到了 160～200g ( DCW/ L) 。
為了提高菌體或代謝產(chǎn)物的終發(fā)酵密度, 需要優(yōu)化高密度培養(yǎng)每一步表達(dá)方式和方法。 微生物培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)慢的原因不僅與培養(yǎng)方式有關(guān), 也與所用培養(yǎng)基、 培養(yǎng)體積有直接關(guān)系。 幾種細(xì)菌高密度培養(yǎng)的研究詳見(jiàn)表 1。限制細(xì)菌高密度培養(yǎng)的主要因素是培養(yǎng)過(guò)程中底 物 對(duì) 菌 體 生 長(zhǎng) 的 影 響 , 具 體 體 現(xiàn) 在 限 制 性 底 物( 高濃度培養(yǎng)基) 的抑制作用、 不穩(wěn)定性和揮發(fā)性底物/ 產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 ( 如產(chǎn)物的分解作用, 二氧化碳的高溶解率以及熱量和氧氣的需求量等) 、 代謝產(chǎn)物或副產(chǎn)物的積累甚至還有培養(yǎng)基粘度等。首先, 微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件在高密度培養(yǎng)過(guò)程中占有很重要的地位。 培養(yǎng)基與產(chǎn)量系數(shù)和比生長(zhǎng)速率之間存在直接關(guān)系, 高濃度的培養(yǎng)基成分對(duì)高密度培養(yǎng)有一定的抑制作用; 培養(yǎng)條件則與發(fā)酵過(guò)程中不同菌體的生理生化特性有關(guān)。 兩者都是在高密度培養(yǎng)過(guò)程中基本和必需的優(yōu)化手段。
其次, 充足的底物是高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ), 培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)流加補(bǔ)料等方式補(bǔ)充菌體所耗費(fèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 其中低濃度氨水是常用的底物之一, 它不僅可以作為氮源的補(bǔ)給還可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的 pH。后, 由于積累的代謝物明顯抑制了菌體的生長(zhǎng), 所以必須去除代謝副產(chǎn)物、 提高比生長(zhǎng)速率。如過(guò)量的碳源導(dǎo)致了代謝物的積累 ( Escherichia. coli的代謝副產(chǎn)物是乙酸鹽, Bacillus subtilis 為丙酸鹽) ,反過(guò)來(lái)這些代謝產(chǎn)物的積累同時(shí)也抑制菌體對(duì)碳源
的利用。總之, 解決菌體濃度低的方法有很多, 但必須結(jié)合工藝過(guò)程的整體特點(diǎn), 考慮才能使菌體濃度達(dá)到高密度 ( 詳細(xì)論述見(jiàn)后) 。 培養(yǎng)基優(yōu)化、 補(bǔ)料策略、 pH 值的選擇以及代謝調(diào)控都是減少代謝產(chǎn)物形成并使菌體以大生長(zhǎng)率達(dá)到高密度培養(yǎng)的有效途徑。
1.3 高密度培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)
與常規(guī)培養(yǎng)相比, 高密度培養(yǎng)在發(fā)酵過(guò)程中有明顯優(yōu)勢(shì)。 它可以提高菌體的發(fā)酵密度或單位體積培養(yǎng)液中菌體的濃度, 進(jìn)而提高體積產(chǎn)率; 可以縮小生物反應(yīng)器體積, 減少生產(chǎn)設(shè)備投資; 強(qiáng)化下游分離提取, 并在一定程度上減少?gòu)U水量; 綜合提高比生產(chǎn)率, 加速產(chǎn)品的商品化進(jìn)程, 降低生產(chǎn)成本,并提高產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。
 2.高密度培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn)方法
用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)的生物反應(yīng)器類型有常用的攪拌罐和帶有外置式或內(nèi)置式細(xì)胞持留裝置的反應(yīng)器, 如透析膜反應(yīng)器、 氣升式反應(yīng)器、 氣旋式反應(yīng)器與振動(dòng)陶瓷瓶等。 高密度培養(yǎng)的途徑主要有透析培養(yǎng)、 細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)、 補(bǔ)料分批培養(yǎng)等, 其中,后者是較為成熟和完善的技術(shù)。
2.1優(yōu)化培養(yǎng)基
在分批培養(yǎng)過(guò)程中, 當(dāng)培養(yǎng)體系中的營(yíng)養(yǎng)成分( 包括碳源、 氮源和無(wú)機(jī)鹽等) 的濃度超過(guò)某一臨界值時(shí), 微生物會(huì)為抵抗高鹽濃度、 維持胞內(nèi)環(huán)境而形成離子梯度。 這一過(guò)程需耗能才能完成, 其結(jié)果會(huì)明顯抑制菌體生長(zhǎng), 降低菌體得率。 這就是分批培養(yǎng)過(guò)程中直接把含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基加入, 而增加的濃度不能獲得高菌體密度的原因, 也是高密度培養(yǎng)往往采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)的原因。 因此, 選擇適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適當(dāng)濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是達(dá)到菌體高密度的重要途徑之一。在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中, 可以根據(jù)產(chǎn)生菌的特性和產(chǎn)品需求有效地控制基質(zhì)培養(yǎng)基的品種和用量, 進(jìn)行深入分析以獲得適合菌體生長(zhǎng)繁殖的增殖培養(yǎng)基。
以桿菌肽為例：培養(yǎng)基中初始葡萄糖耗盡后，控制葡萄糖的流加速率，使培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度維持在一個(gè)穩(wěn)定的濃度，使菌體比生長(zhǎng)速率維持一定的速率， 較好的平衡菌體的初級(jí)代謝與次級(jí)代謝，可避免乙酸等副產(chǎn)物的大量積累， 又能滿足菌體桿菌肽合成的需求。當(dāng)維持葡萄糖濃度過(guò)低時(shí)，無(wú)法維持較高的生物量， 桿菌肽的合成速率低， 影響終的產(chǎn)量。當(dāng)維持葡萄糖濃度過(guò)高時(shí)， 菌體生長(zhǎng)旺盛、 初級(jí)代謝過(guò)強(qiáng)，菌體會(huì)發(fā)生“葡萄糖” 效應(yīng)抑制菌體生長(zhǎng)， 抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物合成。因此維持發(fā)酵過(guò)程中合適的葡萄糖濃度可有效地減少副產(chǎn)物的累積， 提高桿菌肽合成效率。發(fā)酵基礎(chǔ)料中初始葡萄糖濃度為 10g /L，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度下降到一定濃度時(shí)，通過(guò)流加 40% 葡萄糖溶液，維持發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為 1g /L、 2g /L、 3g /L 和 5g /L，結(jié)果使菌體的初級(jí)代謝與次級(jí)代謝達(dá)到理想平衡， 使桿菌肽發(fā)酵達(dá)到理想效果，30h 放罐效價(jià)達(dá)到 1015u /ml。
  
2.2 控制培養(yǎng)條件
適溫度
適溫度隨著菌種、 培養(yǎng)基成分、 培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段變化而改變。 不同的微生物適生長(zhǎng)溫度范圍存在一定的差異。 溫度的變化一方面影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì), 另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。 在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液釋放出大量的熱量, 所以一般情況下實(shí)驗(yàn)所用的發(fā)酵罐都不需要加熱, 相反需要冷卻的情況多一些。 冷卻的方法有兩種, 一是通過(guò)冷卻水熱交換來(lái)降溫, 也可以采用冷凍鹽水進(jìn)行循環(huán)式降溫, 保持恒溫發(fā)酵。
1. pH 值
在高密度培養(yǎng)過(guò)程中, pH 值的變化是菌體產(chǎn)酸或產(chǎn)堿等生化代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果, 也是確定補(bǔ)料速率的依據(jù), 把兩者緊密結(jié)合起來(lái)可以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化。 在響應(yīng)曲面法 pH- stat 流加高密度培養(yǎng)模式中, 就是通過(guò)不斷補(bǔ)料的方法, 成功調(diào)節(jié) pH 使菌體達(dá)到了高密度。
2. 溶氧濃度 ( DO)
在高密度培養(yǎng)中, 溶氧濃度的高低對(duì)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物的合成以及產(chǎn)物的性質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生不同的影響 。隨著菌體密度的增加, 單位體積培養(yǎng)物的攝氧率增加, 使發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平逐漸下降, 低于臨界氧濃度時(shí)就會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。 為了增加發(fā)酵液的溶氧量,需要增大攪拌轉(zhuǎn)速和增加空氣流量。然而, 在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中, 使用純氧容易導(dǎo)致微生物氧中毒。 Meyer 和 Fiechter [16] 曾報(bào)道, 需氧發(fā)酵并不是溶氧越高越好。 適當(dāng)?shù)娜苎跛接欣诰w生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成, 但是溶氧太高有時(shí)會(huì)抑制產(chǎn)物的形成。 因此, 為了正確控制溶解氧濃度, 有必要考察每一種發(fā)酵產(chǎn)物的臨界溶氧濃度和適溶氧濃度, 并使發(fā)酵過(guò)程保持在適溶氧濃度。 可以通過(guò)控制菌的比生長(zhǎng)速率, 使溶氧濃度保持在比臨界值略高一點(diǎn)的水平, 達(dá)到這一目的。
3. 氧化還原電位
氧化還原電位對(duì)專性厭氧微生物的生存有明顯的影響, 過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌體立即死亡。 分子氧對(duì)專性厭氧微生物的毒害作用是由于提高了環(huán)境的氧化還原電位。 環(huán)境中存在的還原性物質(zhì), 如抗壞血酸、H2S 和含巰基的有機(jī)物等, 可以使環(huán)境保持較低的氧化還原電位, 這時(shí)即使有分子氧存在, 專性厭氧微生物也不會(huì)死亡。
4.代謝產(chǎn)物的調(diào)控
代謝產(chǎn)物的調(diào)控是研究高密度培養(yǎng)的一種重要手段。 依據(jù)對(duì)生長(zhǎng)曲線的分析, 培養(yǎng)中導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)停止的主要原因之一是代謝產(chǎn)物的積累和反饋抑制作用。 高密度培養(yǎng)過(guò)程中, 細(xì)胞在電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)代謝中都會(huì)產(chǎn)生乙酸及其它代謝產(chǎn)物。當(dāng)分批培養(yǎng)中的細(xì)胞密度超過(guò)一定濃度時(shí), 菌體會(huì)緩慢甚至停止生長(zhǎng)。 這是由于發(fā)酵過(guò)程中乙酸鹽等鹽類對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了負(fù)面影響, 抑制了蛋白質(zhì)合成的代謝副產(chǎn)物的積累。 目前國(guó)外已有研究希望通過(guò)代謝工程改變細(xì)菌的代謝途徑, 從而降低乙酸等其它代謝物的生成。
3.結(jié)論
隨著市場(chǎng)需求的日益擴(kuò)大, 高密度培養(yǎng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于各種微生物 ( 乳酸菌、 芽孢桿菌、 大腸桿菌等) 的生產(chǎn)中, 它不僅可以改進(jìn)發(fā)酵工藝, 提升其現(xiàn)代化發(fā)酵進(jìn)程, 而且對(duì)于增加單位體積培養(yǎng)液中菌體數(shù)量, 提高生產(chǎn)率, 加速微生物制劑的商品化進(jìn)程, 更好地滿足市場(chǎng)需求, 具有重要而深遠(yuǎn)的意義。