污染向來是在細(xì)胞培養(yǎng)中的大問題。預(yù)防或治理污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。我們在細(xì)胞培養(yǎng)時，在開始階段就要十分重視污染問題，否則會前功盡棄，這樣不僅浪費(fèi)時間，也會浪費(fèi)人力、物力。  

(一)  有哪幾類污染？

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。   

1、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是實驗室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡。   

2、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中見的一種，的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

3、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的小微生物，小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。  

培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。   

4、非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實驗宣告無效。   細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

（二）污染類型的區(qū)別

1、細(xì)菌、真菌污染的檢測

(1)  肉眼觀察 ---- 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。  

(2)  接種觀察 ---- 用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。   

(3)  鏡下觀察 ---- 倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。   

2、支原體污染的檢測

(1)  相差顯微鏡觀察 ---- 接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時可見類似于布朗運(yùn)動的表現(xiàn)。注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。  

(2)  熒光染色法觀察 ---- 熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。  

(3)  電鏡檢測 ---- 條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。  

(4)  培養(yǎng)檢測 ---- 細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。  

3、病毒的檢測

(1)  應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病  

(2)  逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測病毒