開學(xué)季又到了實(shí)驗(yàn)汪又要去“搬磚”了
如何優(yōu)雅的搬磚還不用求助師兄師姐

當(dāng)然是關(guān)注“小奧課堂”欄目啦

今天小奧為各位介紹的
是一篇干貨滿滿的 
噬菌體展示方法實(shí)踐手冊 
“噬菌體的擴(kuò)增與定量”

 這是一份難得的學(xué)霸筆記
請收好（收藏）！ 

Part 1

雜交瘤、單細(xì)胞克隆和噬菌體展示技術(shù)是抗體發(fā)現(xiàn)的三種主流技術(shù)，其中噬菌體展示技術(shù)作為諾獎(jiǎng)級別的技術(shù)，在生物創(chuàng)新醫(yī)藥研發(fā)過程中有著十分重要的作用，極大的加快了抗體類藥物研發(fā)的進(jìn)程。噬菌體展示技術(shù)不僅在新的抗體和多肽的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化過程中有著核心的作用，還能和傳統(tǒng)的動(dòng)物免疫技術(shù)相結(jié)合，與納米抗體、全人源轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)進(jìn)行有效對接，能夠廣泛用于抗體、抗體偶聯(lián)藥物和CAR-T/TCR-T等領(lǐng)域。本文將針對噬菌體展示技術(shù)的噬菌體增殖和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)進(jìn)行探討、分享具體實(shí)驗(yàn)過程的經(jīng)驗(yàn)，以其原理為根本來指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程，以精益求精的實(shí)驗(yàn)過程，增加噬菌體展示技術(shù)在抗體發(fā)現(xiàn)過程中的成功率。

Part 2 

——噬菌體文庫 
 擴(kuò)增及展示的基本原理 | 

現(xiàn)在普遍應(yīng)用的噬菌體展示抗體片段的體系稱之為“3+3體系”（3為噬菌體的p3衣殼蛋白）；3+3代表著p3衣殼蛋白有兩個(gè)來源：

• 噬菌粒（phagemid）
• M13KO7輔助噬菌體(Helper Phage）

菌粒（phagemid）上的p3蛋白融合了抗體片段的基因，是文庫多樣性的關(guān)鍵；輔助噬菌體(Helper Phage)上的p3蛋白為噬菌體天然的p3蛋白。
*噬菌粒是一種比較小的質(zhì)粒載體，在大腸桿菌感受態(tài)中有較高的轉(zhuǎn)化效率，并且能夠在大腸桿菌中擴(kuò)增。

含有噬菌粒的大腸桿菌被輔助噬菌體(Helper Phage)感染后，會(huì)利用大腸桿菌的酶系統(tǒng)、原料和能量進(jìn)行擴(kuò)增,終包含噬菌粒的噬菌體從大腸桿菌釋放出來，該子代噬菌體的p3衣殼蛋白會(huì)展示抗體片段。

Part 3

 ——在噬菌體擴(kuò)增過程中 
 遇到的難題和對應(yīng)的解決方案 | 

噬菌體的建庫過程實(shí)際上是抗體片段基因多樣性的傳遞過程：
從血樣中抗體基因的多樣性傳遞到噬菌粒的過程，是噬菌粒文庫構(gòu)建的內(nèi)容；
從噬菌粒的多樣性傳遞到含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性，是噬菌粒質(zhì)粒電轉(zhuǎn)大腸桿菌的內(nèi)容；
從含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性傳遞到噬菌體的多樣性則是噬菌體擴(kuò)增的內(nèi)容，也是本文實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)關(guān)注的問題。

噬菌體的擴(kuò)增終目的是將噬菌粒中單一拷貝的抗體片段基因通過噬菌體的擴(kuò)增過程變成10-100個(gè)拷貝，且這些拷貝基因能夠在噬菌體表面的p3蛋白上展示出抗體蛋白片段。

在噬菌體的擴(kuò)增過程要使得文庫的多樣性得以保持和傳遞，需根據(jù)文庫的初始大小確定在擴(kuò)增過程中含有噬菌粒的大腸桿菌的數(shù)目和體積，對應(yīng)加入的輔助噬菌體的多少進(jìn)行有效感染，以及擴(kuò)增后加入多少含有噬菌粒的噬菌體進(jìn)行淘選等需要一一計(jì)算評估的問題，不同文庫大小的噬菌體庫在擴(kuò)增過程中需要的擴(kuò)增體積是不一樣的。一份固化的實(shí)驗(yàn)方案很有可能會(huì)導(dǎo)致文庫多樣性的丟失。
要弄清楚這些問題，首先要具備以下幾點(diǎn)基礎(chǔ)的前置知識(shí)：

（??以下內(nèi)容全部劃重點(diǎn)?。。。?/span>

1. TG1大腸桿菌在OD600的讀數(shù)：1OD代表的菌濃度為1e9個(gè)/ml。
2. 噬菌體/輔助噬菌體在TG1處于對數(shù)生長期時(shí)有比較好的感染效率，TG1處于對數(shù)生長期的OD600值在0.4-0.8。
3. TG1在對數(shù)生長期的生長速度是20分鐘一代，需要密切關(guān)注TG1的生長，及時(shí)取菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4. 輔助噬菌體和TG1的比值MOI在20：1時(shí)能夠保證所有TG1被感染上。
5. 含有噬菌粒的噬菌體能夠感染正常的TG1大腸桿菌，并將噬菌粒留在TG1中并隨著TG1的擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增，在無輔助噬菌體的情況下無噬菌體的擴(kuò)增。
6. 噬菌粒質(zhì)粒含有青霉素抗性，輔助噬菌體含有卡那霉素抗性。
7. 含有噬菌粒的噬菌體可以通過感染正常的TG1，梯度稀釋涂青霉素抗性的瓊脂板進(jìn)行滴度測定。8. 3+3模式下含有噬菌粒的噬菌體展示出p3融合抗體片段蛋白的效率比較低，只有5%-10%,在進(jìn)行淘選時(shí)，加入的噬菌體的滴度應(yīng)是文庫多樣性的100倍以上。
還有一個(gè)比較關(guān)鍵的問題是噬菌體作為一種病毒，很容易以氣溶膠的形式擴(kuò)散到空氣中污染實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，從而感染F因子陽性的大腸桿菌。 （心疼一下生物汪，冒著生命危險(xiǎn)搬磚?。。?/s>
在噬菌體展示的相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要在相對封閉的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行以避免噬菌體對于大腸桿菌的污染，特別是在培養(yǎng)正常的TG1大腸桿菌時(shí)。噬菌體的滅活方式通常是紫外照射半小時(shí)以上。
（合格的生物汪，是個(gè)莫得感情的病毒殺手?。?/s>

Part 4 

——噬菌體擴(kuò)增和定量 
 具體實(shí)驗(yàn)過程的分享 | 

以下是以一個(gè)文庫大小為1E9的噬菌體文庫進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)方案。
*如果文庫過大或者過小，可依比例增減擴(kuò)增體積。
 

Day 1
（搬磚禿頭的一天）

1. 取含有噬菌粒的TG1菌種1ml (菌數(shù)目為1E10)加入含有100ml 2xYT-GA培養(yǎng)基250ml搖瓶中，使用奧豪斯搖床37度220rpm搖菌搖床至OD600為約0.5。2. 取OD600為約0.5的菌液20ml (菌數(shù)目為1E10),按照MOI為20：1加入pfu為2E11的輔助噬菌體M13 K07，37度220rpm振蕩半小時(shí)進(jìn)行感染。3. 取感染后菌液到50ml離心管使用奧豪斯離心機(jī)5816R 3200g離心10分鐘，去除培養(yǎng)基，以除去培養(yǎng)基中的葡萄糖對噬菌粒中p3蛋白融合了抗體片段蛋白表達(dá)的抑制。4. 用2xYT-AK培養(yǎng)基重懸菌團(tuán)，將培養(yǎng)基加至400ml，用1L搖瓶在30度220rpm過夜搖菌。

Day 2
（搬磚禿頭的第二天）

5. 將400ml菌液均分至大的離心瓶中，使用奧豪斯離心機(jī)5816R 10000g離心10分鐘，取上清，10000g再次離心10分鐘，去除殘留的菌體碎片。6. 取90ml PEG溶液加入400ml上清液中，在4℃孵育1小時(shí)并伴隨著柔和的振蕩，然后使用帶低溫控制功能的奧豪斯離心機(jī)5816R 4℃10000g離心1小時(shí)。7. 去上清，用10mlPBS重懸噬菌體后，加入2.5ml PEG溶液再次沉淀.8. 冰上孵育20分鐘，然后使用帶低溫控制功能的奧豪斯離心機(jī)5816R 4℃ 10000g離心半小時(shí)。9. 去上清液，用吸水紙吸干殘留的PEG溶液，加入1-2ml的PBS重懸噬菌體，進(jìn)行滴度測定。

滴度測定：
1. 在分隔的實(shí)驗(yàn)室，取正常的TG1大腸桿菌加入2xYT的培養(yǎng)基中，使用奧豪斯搖床搖菌至OD600值為0.5，如未能及時(shí)使用，可放入4℃ 2小時(shí)以備用。
2. 將步驟9中擴(kuò)增噬菌體原液用PBS稀釋1E5-1E7倍。
3. 取10ul噬菌體稀釋液加入490ul OD600為0.5的TG1大腸桿菌中，使用奧豪斯搖床 37℃ 220rpm振蕩半小時(shí)進(jìn)行感染。
4. 取感染液50ul均勻涂抹在含有2xYT-GA的瓊脂板中，晾干后放入37℃培養(yǎng)箱過夜。并將未感染TG1大腸桿菌涂抹瓊脂板作為陰性對照。
 

Day 3
（搬磚禿頭的第三天）

5. 數(shù)2xYT-GA的瓊脂板中的克隆數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算擴(kuò)增噬菌體的滴度
噬菌體滴度(pfu/ml)=（克隆數(shù)*10*50/10ul）*稀釋倍數(shù)
6. 取1E11-1E12的噬菌體用于淘選。

試劑配方：
2xYT培養(yǎng)基：Yeast Extract 10.0 g/L+Tryptone 16.0 g/L+NaCl 5.0 g/L
2xYT-GA培養(yǎng)基: 2xYT培養(yǎng)基+100 μg/ml 青霉素+ 1% （W/V）葡萄糖
2xYT-AK培養(yǎng)基：2xYT培養(yǎng)基+100 μg/ml 青霉素+50 μg/ml卡那霉素
PEG溶液：20% (w/v) PEG 6000, 2.5 M NaCl
 

Part 5
儀器推薦：

（做科研民工的每一天都不孤單，因?yàn)橛行W陪伴）

噬菌體作為一種病毒，很容易以氣溶膠的形式擴(kuò)散到空氣中污染實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，需要封閉的實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室所有的儀器需單獨(dú)使用。
奧豪斯恒溫輕負(fù)載培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速范圍為100-12—rpm,體積集約，功能強(qiáng)大，可為您的樣品提供優(yōu)異的搖蕩效果：

此外，噬菌體展示實(shí)驗(yàn)的過程中會(huì)有不同體積、不同轉(zhuǎn)速和需要4℃條件的離心步驟，如果以多
臺(tái)離心機(jī)滿足實(shí)驗(yàn)的需求會(huì)造成實(shí)驗(yàn)設(shè)備資產(chǎn)的空置，造成極大的浪費(fèi)！！！

奧豪斯5816R多功能離心機(jī)和可選轉(zhuǎn)子為噬菌體相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供便利，一臺(tái)離心機(jī)滿足所有實(shí)驗(yàn)需求！

接下來，小奧帶你乘坐
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