【普渡大學2019 OPRD案例】采用荷蘭Chemtrix微通道反應器快速按需合成抗癌藥物洛莫司汀

【背景介紹】

洛莫司汀（Lomustine），是一類被廣泛使用的高親脂性烷基化抗癌藥物，通過在體內產(chǎn)生氯乙基碳離子和碳?；虚g體，這些親電化合物攻擊DNA上的親核部位，形成烷基化產(chǎn)物，從而發(fā)揮藥效作用的。其他類別的抗癌藥物，比如鏈霉素、博來霉素和蒽環(huán)類，需要生物激活作用（bioactivation）來與細胞靶點反應，而洛莫司汀不需要預激活。不同于作用于鳥嘌呤的N7烷基化試劑，洛莫司汀則在O⁶形成氯乙基化加合物，進而導致鏈間DNA的交聯(lián)。如果DNA不進行修復，這種交聯(lián)會在DNA復制過程中導致雙鏈斷裂，終細胞凋亡導致細胞死亡。洛莫司汀作為一種可口服抗腫瘤藥，每6周服用一次。它早是在20世紀60年代后期進行的臨床試驗評估，并于1976年獲得FDA的批準，用于治療原發(fā)性和轉移性腦腫瘤以及霍奇金淋巴瘤。百時美施貴寶初以CeeNu品牌持有該藥物的zhuanli。2014年，F(xiàn)DA批準Next Source Biotechnology公司被以Gleostine的商標對洛莫司汀進行重新包裝。近，Gleostine的平均批發(fā)價格出現(xiàn)了大幅上漲，其原因是處理致癌化合物所產(chǎn)生的監(jiān)管風險 。因此，這促使我們努力開發(fā)一種通過連續(xù)流動技術合成洛莫司汀的方法。

流動化學技術近在工業(yè)界和學術實驗室中都進行了廣泛的探索，被證實是一種有效的合成技術。與傳統(tǒng)的釜式合成工藝相比，由于連續(xù)流技術可以快速混合和控制反應參數(shù)，進而更好地控制反應條件和選擇性，如溫度、化學計量、壓力和保留時間。強化的傳熱和傳質能力也提供了更安全的操作條件。連續(xù)流合成的工藝強化可以有助于提高化學反應效率，縮短反應時間，減小反應規(guī)模，提高產(chǎn)品的質量和一致性。因此，原料藥的連續(xù)流合成技術在近幾年變得吸引力。然而，由于工作條件、溶劑切換和流速差異等因素的限制，通過連續(xù)流技術有效地執(zhí)行多步反應仍然是一個挑戰(zhàn)。此外，連續(xù)流方法的反應條件的優(yōu)化和分析技術仍需要大量人力物力的投入。

【連續(xù)流方法】

Purdue大學的David H. Thompson課題組近日報道了洛莫司汀通過連續(xù)流合成的新工藝方法，并使用解吸電噴霧電離質譜（DESI-MS）對其進行分析檢測指導工藝的優(yōu)化方案。終工藝路線是兩個反應串聯(lián)在一起，不分離中間體，具備反應器裝置簡易、原料廉價等特點因此可以降低生產(chǎn)成本（反應流程如圖1所示）。相關結果發(fā)表在Org. Process Res. Dev.2019，23，3，334-341（DOI：10.1021/acs.oprd.8b00387）雜志上。

圖1 使用連續(xù)流技術兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的工藝路線，其中4 = NaNO2/HCO2H ，5 = tBuONO

洛莫司汀合成的步在室溫下是快反應。在連續(xù)流中對該反應的溫度、溶劑和投料比進行優(yōu)化，進而確定獲得大產(chǎn)品收率的條件。檢測反應使用TLC和MS，其中MS使用正離子模式下三重四極質譜儀，以快速探測出每種反應條件下的全質譜和產(chǎn)物離子分布。

為了揭示步的佳條件，作者設計了一種級聯(lián)方法。運用荷蘭Chemtrix微通道反應器，選用 3225 SOR靜態(tài)混合區(qū)芯片，泵送環(huán)己胺（1），1-氯-2-異氰酸乙酯-乙烷（2）和三乙胺（TEA）溶液，自動進樣器自動收集小瓶中的產(chǎn)品（如圖2所示）。蒸發(fā)反應混合物，用冷Et2O洗滌白色固體并真空干燥，然后用TLC、MS、MS/MS和NMR（1H和13C）分析。

圖2 合成中間體 3的Chemtrix微反應器 glass reactor chip (SOR 3225). A = 1 in THF; B = 2 in THF, C = TEA in THF.

作者對該步反應使用的保留時間（τ）、反應溫度（T）、1-氯-2-異氰酸乙酯/環(huán)己胺比等條件進行探討。如圖3所示，在較長的保留時間下，EtOH為溶劑的產(chǎn)品產(chǎn)量急劇下降（Entry1-3），原因是因為1-氯-2-異氰酸乙酯會被溶劑醇解，盡管3在ACN中的收率很高，但它在該溶劑中的溶解度很低，導致嚴重堵塞。對于甲苯和Et2O，即使在低濃度下也發(fā)現(xiàn)了類似的堵塞問題（Entry7-8）。而在溶劑THF中，產(chǎn)率在在50 oC下30 s達到大值（Entry9-14），并且由于高溫會導致產(chǎn)物分解，溫度升高，產(chǎn)率會下降（Entry13-14）。提高2的當量可以提高產(chǎn)率（Entry15-21），而延長保留時間，也可能會導致產(chǎn)品分解(Entry21)。終，作者確立了佳的反應條件：τ = 60 s, T = 50 °C,  1.4 當量的1-氯-2-異氰酸乙酯。在該條件下，反應的高產(chǎn)率可達到92%（Entry 20）。

圖3 合成中間體3的反應條件篩選

對于第二步的合成，作者使用DESI-MS來評估溶劑、濃度和硝化試劑類型對洛莫司汀產(chǎn)率的影響。DESI-MS初應用于完整樣本的表面分析，如癌癥診斷用生物組織或藥物檢測指紋圖譜。在近，DESI-MS方法已用于化學反應分析。該方法主要目的是在受限的體積內產(chǎn)生反應加速現(xiàn)象，比如在MS噴霧電離過程的微液滴中，通過這種技術可以達到5ms的分析速度，每小時接近一萬個反應點。

作者使用了這項技術來研究兩種亞硝化方法，首先，評價了亞硝酸鈉、甲酸作為亞硝化試劑對中間體3向洛莫司汀轉化的效率。然后將該轉化率與亞硝酸叔丁酯（TBN，5）作為亞硝化試劑進行比較。用DESI-MS研究了NaNO2/HCO2H體系不同反濃度和溶劑條件下的轉化效果。在探究中，洛莫司汀的分子離子峰m/z= 234未被觀察到。對市售洛莫司汀樣品的分析兩者產(chǎn)生了非常相似的質譜，這表明電離過程中該分子很容易發(fā)生碎裂。通過三重四極質譜與電噴霧電離，以及離子阱質譜聯(lián)用DESI，質譜中得到了一個穩(wěn)定的固體碎片離子在m/z 169。該反應產(chǎn)生的洛莫司汀碎片與市售的洛莫司汀相匹配這一事實進一步證實了這一點。THF/H2O中所有NaNO2濃度的反應比ACN/H2O的反應效果更好（圖4a）。此外，與THF/H2O反應相比，來自3的碎片在ACN/H2O反應中為豐富，表明起始物質在ACN/H2O中的轉化相對緩慢。接下來，將8種不同溶劑（EtOH、MeOH、DCM、ACN、甲苯、DMSO、THF和EtOAC）進行結果比較優(yōu)化連續(xù)流合成。所有八種溶劑都使用4作為亞硝化試劑并得到了類似的結果（圖4b）。當使用5作為硝化試劑時，在除THF和EtOAc以外的所有溶劑中都檢測到洛莫司?。▓D4c）。

圖4 DESI-MS 樣品盤顯示了在合成洛莫司汀的條件篩選中是否存尋找的離子峰，藍色點表示m/z169出現(xiàn)了（成功反應），紅色點則表示沒有出現(xiàn)（不成功反應） (A) NaNO2作為硝化試劑時的濃度篩選. (B) NaNO2作為硝化試劑時的溶劑篩選(C) tBuONO 作為硝化試劑時的溶劑篩選

接下來，作者利用DESI-MS高通量實驗中得到的反應條件來優(yōu)化連續(xù)流合成，并檢查由DESI-MS確定的不成功反應在流量條件下是否會產(chǎn)生負遷移。從DESI-MS實驗中可知，THF是使用4進行亞硝化反應的佳溶劑。由于亞硝化試劑是吸濕的并且容易氧化成硝酸鹽，反應常常會使用過量的4，進而將3大限度地轉化為洛莫司汀?？偟膩碚f，DESI-MS實驗在投料比、試劑和溶劑方面與流動反應條件的結果非常一致。在連續(xù)流反應中篩選洛莫司汀的轉化率（圖5）。作者使用TLC和MS檢測反應。初，在0°C、保留時間為30s的條件下。令人欣慰的是，在這么短的反應時間內獲得了洛莫司汀，雖然轉化率很低（圖6，Entry1）。適當提高保留時間可以提高轉化；然而，較長的保留時間似乎增加了對洛莫司汀的分解(Entry2-6)。同時，作者將溫度保持在0°C，以避免NaNO2分解成高溫下產(chǎn)生的重氮鹽。

圖5 合成洛莫司汀的微反應器，在 Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用NaNO2 /HCOOH（4）作為硝化試劑，A = 3 in THF; B = HCO2H , C = NaNO2 in MeOH/H2O (4:1).

接下來，作者對洛莫司汀的不同分離chun化方法進行了評價。首先，用Et2O（3次）萃取產(chǎn)物，以利用3在該溶劑中的低溶解度（Method 1）。不幸的是，薄層色譜分析顯示有機層和水層中都存在3。只好將有機萃取物經(jīng)無水Na2SO4干燥并在真空中濃縮以產(chǎn)生黃色油，該油在Et2O中重新溶解，在冰浴中冷卻以從混合物中沉淀3。對濾液的NMR分析顯示，仍有22%的3殘留在分離的洛莫司汀產(chǎn)品中。接下來，作者換用ACN（Method2）重結晶來純化產(chǎn)物。雖然得到了非常純的洛莫司汀，但使用這種方法的回收率很低。后，作者發(fā)現(xiàn)使用石油醚熱過濾可去除不溶性雜質3（Method3）。干燥后濾液濃縮得到純的洛莫司汀，通過NMR分析檢測不到3。采用此方法，在0°C，保留時間為5分鐘，3當量4的反應條件下，以74%的分離收率得到純的洛莫司汀。

圖6 使用4作為硝化試劑時，不同反應條件下洛莫司汀的分離收率

當使用5作為亞硝化劑時，作者也在保留時間、溫度和溶劑方面對反應進行了優(yōu)化（反應裝置如圖7所示）。結果表明，在保留時間（8分鐘）、降低溫度（25°C）和增加5的比率（3當量）的條件下，通過方法3chun化后，洛莫司汀有了進一步的提高（91%分離收率）。

圖7 合成洛莫司汀的微反應器，在 荷蘭Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用tBuONO（5）作為硝化試劑，A = 3 in ACN/ EtOH (3.7:1); B = 5 in ACN.

下一步研究了連續(xù)流裝置下的兩步串聯(lián)反應，作者使用荷蘭Chemtrix反應器來觀察碳?；蛠喯趸磻?。然而，在兩個步驟之間需要萃取，以去除反應中存在的三乙胺，避免在第二步驟中競爭性地消耗亞硝化試劑。作者通過在亞硝化步驟之前使用市售Zaiput液-液萃取器去除堿，并通過使用FEP管式反應器重新優(yōu)化合成來實現(xiàn)這一目標（圖8）。開始時，佳反應條件為：步在50°C下，保留時間1分鐘，第二步在0°C下，保留時間5分鐘，得到43 mg（總收率51.8%）的chun洛莫司汀（圖9，Entry 1）。在使用4作為亞硝化試劑的條件下，通過改變步或第二步的保留時間來提高FEP管式反應器中洛莫司汀產(chǎn)率是不能成功的（Entry 1-4）。

圖8 利用4做為硝化試劑，兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的實驗裝置

而在隨后的實驗中結果表明，5比4是一種更好的合成洛莫司汀的亞硝化試劑。終的優(yōu)化條件包括步在50℃下的1分鐘反應時間和第二步在25℃下的8分鐘反應時間（如圖10所示）。由于從步提取的少量三乙胺對TBN活性產(chǎn)生了影響，降低所用三乙胺的量使得洛莫司汀產(chǎn)量增加（表4，Entry 7-9），通過該反應裝置制得110 mg的洛莫司?。ū?，條目9），總收率為63%。通過這種串聯(lián)反應路線制得的洛莫司汀的經(jīng)TLC、NMR（1H和13C）、MS和MS/MS表征與市售的洛莫司汀樣品的測定值相同。

圖9 串聯(lián)反應合成洛莫司汀的條件篩選

采用液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS）對合成的洛莫司汀進行chun度鑒定，并將該物質的總離子色譜（TIC）值與市售的洛莫司汀標準品進行比較。TIC與商業(yè)標準品*重疊，沒有出現(xiàn)任何新的副產(chǎn)品。

圖10 利用5做為硝化試劑，兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的實驗裝置

【實驗結論】

1.作者利用DESI-MS開發(fā)了一種快速連續(xù)合成洛莫司汀的方法，指導了二步整體轉化中第二步反應條件的優(yōu)化。

2.該工藝采用9分鐘的總保留時間，以63%的總分離收率生產(chǎn)chun品洛莫司汀，與釜式反應相比，無論從收率和效率方面都有了很大的提高。

3.亞硝酸叔丁酯（5）是一種溫和而的亞硝化試劑，并且可以通過簡單的提取、過濾和洗滌來分離chun洛莫司汀。這是一個更快更綠色的合成工藝，該工藝可以顯著縮短反應時間，減少廢物產(chǎn)生，避免任何色譜分離步驟。使用這種方法，每小時可以產(chǎn)生110 mg的洛莫司汀。同時作者也在對洛莫司汀放大生產(chǎn)和在線再結晶進行探討。

Reference

Org. Process Res. Dev.2019，23，3，334-341

公司簡介：

深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應器）、英國AM公司（連續(xù)多級攪拌反應器、催化加氫系統(tǒng)）、英國NiTech公司（連續(xù)結晶儀、連續(xù)合成儀）在中國區(qū)的代理商和技術服務商，為廣大高校和企業(yè)提供連續(xù)合成、在線萃取、連續(xù)結晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續(xù)工藝解決方案。

公司與復旦大學、南京大學、中山大學、華東理工大學、南京工業(yè)大學、浙江工業(yè)大學、河北工業(yè)大學等高校研究機構合作成立微通道連續(xù)流化學聯(lián)合實驗室，致力于推動連續(xù)流工藝在有機合成、精細化工、制藥行業(yè)、能源材料、食品飲料等領域的應用，合作實驗室可以為客戶的傳統(tǒng)間歇釜式工藝在連續(xù)流工藝上的轉變提供工藝驗證、連續(xù)流工藝開發(fā)工作，促進制藥及精細化工企業(yè)由傳統(tǒng)間歇工藝向綠色、安全、快速、經(jīng)濟的連續(xù)工藝轉變。

公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺州、江蘇南京合作組建了連續(xù)流微通道工業(yè)化應用技術中心（以下簡稱“工業(yè)化技術中心”），旨在打造集連續(xù)流微通道工藝開發(fā)、中試試驗、工業(yè)化驗證、技術交流于一體的綜合性連續(xù)流微通道應用技術服務中心，以為廣大生物醫(yī)藥企業(yè)、化工類企業(yè)提供專業(yè)、完善的智能化連續(xù)流工藝整套系統(tǒng)解決方案及技術服務方案。