一、工作原理
分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團(tuán)吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質(zhì)就有其*的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。
分光光度分析就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團(tuán)的信息。可以用標(biāo)準(zhǔn)光圖譜再結(jié)合其它手段進(jìn)行定性分析。
根據(jù)Lambert-Beer定律說明光的吸收與吸收層厚度成正比，比耳定律說明光的吸收與溶液濃度成正比；如果同時考慮吸收層厚度和溶液濃度對光吸收率的影響，即得朗伯-比耳定律。即A=εbc，(A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為液池厚度，c為溶液濃度)就可以對溶液進(jìn)行定量分析。
將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)*一致。如果沒有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照進(jìn)行比較。這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測定條件要相同。
實驗證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強(qiáng)度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強(qiáng)度，以確定選擇哪一種溶劑。
二、紫外可見分光光度計的工作環(huán)境
1）分光光度計安放在干燥的房間內(nèi)，使用溫度為5-35℃，相對濕度不超過85%
2）儀器應(yīng)放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，且避免強(qiáng)烈的震動或持續(xù)的震動
3）室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)，且應(yīng)避免直射日光的照射
4）電扇不宜直接向儀器吹風(fēng)，以防止光源燈因發(fā)光不穩(wěn)定而影響儀器的正常使用
5）盡量遠(yuǎn)離高強(qiáng)度的磁場、電場及發(fā)生高頻波的電氣設(shè)備
6）避免在有硫化氫等腐蝕性氣體的場所使用
二、減除紫外可見分光光度計因素誤差的措施
1、減除入射光束單色性不純的影響
各種不同的分光光度分析儀器除了本身的質(zhì)量決定其單色光的純度不同外，使用或操作也會影響單色光的純度，例如對同一臺分光光度計，由于出射狹縫調(diào)節(jié)不當(dāng)就會使單色光純度差。因此除了應(yīng)該根據(jù)分析的要求選擇適當(dāng)?shù)膬x器外，還必須正確的使用儀器。
2、減除雜散光的影響
雜散光的主要來源是儀器的光學(xué)元件保護(hù)不好，例如透鏡或反射鏡上有塵埃或指紋印。分光光度計光學(xué)系統(tǒng)的暗箱中的黑體被劃傷或脫落，在操作時樣品室蓋未蓋好等。因此要消除雜散光應(yīng)注意以下幾點。
1）做好分光光度計（特別是光學(xué)系統(tǒng)）的防潮和防霉工作。不允許用手或其他硬物摸碰光學(xué)元件和暗箱的黑體
2）保護(hù)好吸收池架，并應(yīng)經(jīng)常保持其清潔和干燥
3）測定時，必須蓋好樣品室蓋
3、減除吸收池誤差
吸收池的質(zhì)量（主要是精度）不好或使用不當(dāng)都會給測定結(jié)果帶來誤差。即使是同一組的數(shù)個同規(guī)格的吸收池，也不能保證其光程長度相等，只是其誤差在一定的范圍之內(nèi)。為了減除由此而產(chǎn)生的誤差，使用時應(yīng)對吸收池進(jìn)行校正。