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LC-500HPLC液相色譜儀在原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測中的應(yīng)用
1 范圍
本方法參照《GB/T 22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量測定；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜（包括氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜）法同時(shí)適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性確證。本液相色譜法的定量限為2 mg/kg。
2.1 原理
試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜測定，外標(biāo)法定量。
2.2 試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
2.2.1甲醇：色譜純。
2.2.2乙腈：色譜純。
2.2.3氨水：含量為25％～28％。
2.2.4三氯乙酸。
2.2.5檸檬酸。
2.2.6辛烷磺酸鈉：色譜純。
2.2.7甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混勻后備用。
2.2.8三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻
后備用。
2.2.9氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混勻后備用。
2.2.10離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)
節(jié)pH 至3.0 后，定容至1L 備用。
2.2.11三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%。
2.2.12三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶
中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保
存。
2.2.13陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯
基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化。
2.2.14定性濾紙。
2.2.15海砂：化學(xué)純，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO2）含量為99％。
2.2.16微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相。
2.2.17氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?/span>99.999％。
2.3 儀器和設(shè)備
| Pos | Product Number | Qty |
| 1 | TZ500-010 | 1 |
| 高壓輸液泵 | ||
| LC-500A Pump Includes pump, solvent cabinet, 2 solvent bottles and CAN cable. | ||
| | ||
| 4 | TZ500-016 | 1 |
| 儀器啟動(dòng)工具包 | ||
| HPLC Starter Kit incl. 0.17mm id cap | ||
| | ||
| 5 | TZ500-040 | 1 |
| SPD-500可變波長紫外檢測器 | ||
| SPD-500 Variable Wavelength Detector Includes variable wavelength detector with deuterium lamp and CAN cable. No flow cell included. | ||
| | ||
| 6 | TZ500-027 | 1 |
| 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥 | ||
| | ||
| 7 | TZ500-028 | 1 |
| C8 250*4.6 | ||
| | ||
| 8 | TZ500-45 | 1 |
| 溶劑托盤 | ||
| | ||
| 9 | TZ500-112 | 1 |
| 色譜工作軟件 | ||
| HPLC 2D ChemStation Software For data acquisition. | ||
| | ||
| 10 | | 1 |
| 柱溫箱 | ||
| | ||
| 12 | 超聲波發(fā)生器 | 1 |
| 真空泵 | ||
| 溶劑過濾器 | ||
| | ||
| 13 | | 1 |
| 提取柱：20cm×2.5cm | ||
| 萃取裝置（含氮吹儀） | ||
| |
2.4 樣品處理
3.4.1提取
2.4.1.1 液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
稱取2 g（至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和5 mL
乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液
潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
2.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
稱取2 g（至0.01 g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)
移至50 mL具塞塑料離心管中，用15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中，
再往離心管中加入5 mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超聲提取10 min，……加入5 mL水混勻后做待凈化
液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
2.4.2凈化
將3.4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，
用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)?/span>
吹干，殘留物（相當(dāng)于0.4 g樣品）用1 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜（3.2.16）后，供HPLC
測定。
2.5 液相色譜測定
3.5.1 HPLC 參考條件
a） 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b） 流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c） 流速：1.0 mL/min。
d） 柱溫：40℃。
e） 波長：240 nm。
f） 進(jìn)樣量：20 μL。
3.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，
濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品
HPLC 色譜圖參見圖A.1。
| 三聚氰胺標(biāo)品色譜圖A.1 |
2.5.3定量測定
待測樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
3.5.4結(jié)果計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：
式中：
X ——試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c ——標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V ——樣液zui終定容體積，單位為毫升（mL）；
As ——標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；
m ——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
f ——稀釋倍數(shù)。
2.6 空白實(shí)驗(yàn)
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進(jìn)行。
2.7 方法定量限
本方法的定量限為2 mg/kg。
2.8 回收率
在添加濃度2 mg/kg～10 mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。
2.9 允許差
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
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