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DNA合成儀功能原理使用方法日常維護基本結構

來源：蘇州亞凡生物技術有限公司 2011年04月01日 10:56

DNA合成儀

設計用于合成結構上類似DNA或RNA的寡核苷酸的自動化儀器。一般應用于固相合成法，每次將一個核苷酸加到所接長的寡核苷酸鏈上，加入每一個核苷酸都利用相同的化學反應與相應的嘌呤或嘧啶堿基衍生物作用。所用化學反應和操作細節(jié)隨不同的儀器而改變，zui廣泛應用的方法是DNA合成的磷酸酰胺法。

功能及原理

基本組成結構和性能

（一）壓力系統(tǒng)

　　系統(tǒng)壓力由超純氬（99．998％）提供。氬氣密度高、氧污染少，因此高壓氬氣常常用來啟動真空輔助系統(tǒng)及供給合成儀調節(jié)器。進入合成儀的氬氣通過10txm的顆粒過濾器后送到3個壓力調節(jié)器，調節(jié)器將氬氣輸送到特定的壓力閥來增加試劑和溶劑瓶的壓力。調節(jié)器也將氬氣供給柱子和試劑閥體。

（二）試劑和溶劑儲液瓶

　　儀器上每個儲液瓶都有特定的位置，儲液瓶蓋座和儀器上所有號碼相對應，儀器上的位置或儲液瓶的編號都是1—8（5個堿基的儀器為1～5）、9、10、11、12、14、15、18和19（配有自動分析的儀器）。將1～8號瓶向上推，在聚四氟乙烯插塞周圍有一“O”形環(huán)，每一瓶頸內部形成一氣密塞。因為試劑輸送系統(tǒng)是要加壓的，所以要使瓶

　　子與儀器之間的密封塞保持氣密性。選擇合適的一次性塞及在瓶上加“O”形環(huán)可以加強氣密性。

（三）壓力管路及輸送管路

　　每個瓶子都有一個氬氣壓力管道及輸送管道進入瓶蓋插塞，對于亞磷酰胺，1—8號瓶其壓力管道也作為排氣管。氬氣管要保持在液體水平以上，而輸送管卻伸到瓶的底部。當閥門正確設置打開時，儲液瓶上部空間由氬氣加壓，液體被推進輸送管，流到其目的地。

（四）亞磷酰胺瓶排氣

　　除了加壓外，亞磷酰胺瓶都是用壓力排氣管排氣的。把亞磷酰胺放人儀器前，要用氬氣排除空氣使其凈化。凈化是通過輸送管輸送氣體，當氣體輸送到瓶內時，空氣經壓力排氣管排出。這是由瓶子更換步驟自動完成的。廢液瓶是輸送系統(tǒng)的低壓側，必須將出口與大氣相通。要確保排氣管通到通風柜。如果排氣管阻塞，將會產生反壓，試劑和溶劑的輸送會受到抑制。

（五）輸送閥塊

　　試劑輸送系統(tǒng)包括兩個試劑閥塊（8堿基儀器有3個）及2個或4個柱閥塊。閥塊控制氣體和化學試劑流人柱子及出口。除亞磷酰胺和四唑以外，試劑和溶劑都被同時輸送到所有活化柱。當有多個活化柱時，對流速的細微變化，以自動調節(jié)每個柱子的輸送次數來補償。每一個5—端口柱閥塊將流出物導人廢液口、DMT收集口，或DNA收集瓶，它也控制用于除去或沖洗柱內和柱閥塊內的試劑的氬氣。

（六）輔助真空

　　對于閥塊的適當運行，關鍵是隔膜形成一個圓頂小空隙，每次電磁閥打開時，抽氣泵為每個閥塊提供了輔助真空，輔助真空在隔膜的螺線管一側形成，使隔膜形成一圓頂空隙。

（七）柱子

　　起始結合在載體上的核苷酸是裝在一次性的柱子中，除柱體外，還有2個固定過濾板和2個接頭，所有的部件都由惰性材料制成。固定過濾板是多孑L性聚苯乙烯固定在兩端蓋子中。人口和出口都是母路厄氏（1uer）接頭，與儀器的公路厄氏接頭配對。柱子是對稱的（沒有頂端和底部、前后之分），可以以任何方式與公路厄氏接頭相連接。每一個柱子都用顏色編號，表示不同的起始核苷酸，以及有一個*的連續(xù)順序號碼。正常的流路是從底部進入，通過向上輸送液體，使CPG顆粒上升并保持懸浮狀態(tài)。溶劑和試劑的流速已經設置好，能使顆粒適當地混合。

（八）路節(jié)流閥

　　試劑通過底部的luer接頭，流到柱子，如果沒擰上下面的一個luer接頭，應會在一個圓柱形的玻璃流路節(jié)流閥上發(fā)現(xiàn)。試劑通過流路節(jié)流閥中一個很小的通道流到柱子。小量的試劑可以在流路節(jié)流閥中結晶，長期這樣會造成流路阻塞。

（九）廢液和排氣

　　大多數化學試劑輸送的zui終點是廢液瓶，廢液瓶是一個空立著的10L的聚苯乙烯容器，可放在合成儀附近的地板上或放在低于儀器的附近工作臺上。排氣管將廢氣導人適當的排氣裝置，如排煙罩

（十）電導池

　　電導流動池是為了測定在每個DNA合成循環(huán)內釋放的DMT陽離子的總電導而設計的。流動池是由一空隙隔開的兩個電極組成，在空隙之間應用一小電壓。DMT陽離子流過電導池時起電導作用。

（十一）電池

　　DNA合成儀一般帶有鋰電池，可以使用幾年。當主電源斷開時，所有的合成參數都被保留下來。這些參數包括儲存的DNA序列，用戶設定的循環(huán)、步驟和功能，以及瓶子使用資料等。如果正在合成中電源出現(xiàn)故障，合成將被中斷，只有主電源恢復時合成才可重新開始。電池還保持合成儀內部的時鐘計時。

（十二）控制器

　　控制器指導和初始合成儀的所有活動，它的主要部分是軟件、微處理機、顯示屏幕、鍵板及相關的電子部件。軟件控制合成的所有必要操作并由微處理機來解釋和執(zhí)行。軟件儲存在一個可取出的存儲卡中，這個存儲卡插在儀器的背面。合成信息顯示在液晶顯示屏上，通過選擇鍵板上的鍵可與儀器交流。軟件是“菜單驅動”，通過按適當的鍵，可選擇一項，給予指令。為了完成自動合成，軟件應用一個包含一系列步驟的循環(huán)來完成全部化學反應。

使用方法操作步驟

　　以亞磷酰胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷酰胺DNA合成的試劑有：保護堿基的5／—DMT，A、G、C、T亞磷酰胺單體，四唑偶聯(lián)催化劑，乙酐，N—甲基咪唑封閉試劑，三氯乙酸（TCA）脫保護溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶劑，氨水切除溶液。使用步驟如下：

　　1）仔細檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量，必要時換掉試劑瓶，特別注意乙腈的量，因為該溶劑用量較大。

　　2）將標記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。

　　3）將要合成的DNA序列輸入合成儀。

　　4）檢查選擇的合成步驟是否正確。

　　5）選擇結束方法：TritylOffAuto是儀器的原始狀態(tài)，若打算以5，—DMT基團連接純化寡核苷酸，將其轉變?yōu)門ritylOnAuto結束狀態(tài)。

　　6）選擇結束方法，一般為系統(tǒng)的原始狀態(tài)。

　　7）在每個柱監(jiān)視器的Username下，輸入你所希望的保存名字。

　　8）以代碼代替相應的DNA序列標記每一個收集瓶。

　　9）打印出每一個柱設置的詳細資料。

　　10）檢查打印出來的資料是否正確。

　　11）運行StartColumn步驟檢查每一個柱的位置，確保合成儀上合成柱處于正確的位置。

　　12）檢查連接在合成儀上的溶劑殘留（廢液瓶）是否充滿。

　　13）如果分部收集器用來收集每個DMT脫保護步驟的流出物，確保試管充分清潔干凈，并打開分部收集器，確保DMT廢液管路通向分部收集器。

　　14）啟動循環(huán)，運行開始程序清洗試劑管路，除去原來的試劑。

　　注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，并將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中。

日常維護

　　1．瓶塞“O”形環(huán)

　　一月檢查一次“O”形環(huán)，zui少1年更換1次。將新的備用“O”形環(huán)與儀器上的相比較，如果在“O”形環(huán)上出現(xiàn)白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，進行清洗。更換“O”形環(huán)的步驟如下：用止血鉗夾住“O”形環(huán)，從槽中取下（或用牙簽鉤下），注意不要損壞托住“O”形環(huán)的白色聚氟乙烯插塞（tefloninsert）；確保插塞上沒有顆粒后，用手指將新“O”形環(huán)推進槽，進行壓力實驗。

　　2．儲液瓶

　　瓶子都要放在亞磷酰胺及儲液瓶位置上，并保持氬氣壓力以及管路清潔。

　　3．流路節(jié)流閥

　　為了防止阻塞，節(jié)流閥應該1個月清洗1次，清洗時，先在水中煮沸15min，然后再在甲醇中超聲波清洗。

不同型號DNA/RNA合成儀的特點與性能簡介

　　PE公司391型DNA／RNA合成儀

　　美國PE公司應用生物系統(tǒng)部（原美國應用生物系統(tǒng)公司，ABl）于1982年推出了世界上*臺全自動DNA合成儀。391型DNA／RNA合成儀可滿足不同科研工作者對高產率、高純度DNA、RNA的需求。該儀器采用固相亞磷酰胺合成法，配有多種規(guī)格合成柱，可滿合成大量的長片段DNA；合成試劑純度>99.8％；每步偶聯(lián)效率>98．5％，保證一般情況下可合成100bp以上核酸片段，而且合成的片段純度高、產率高；每步循環(huán)時間5—6min，合成時間短；可以合成混合引物或探針，即保證在引物某一位點各種堿基有同等摻人率；引物可使用寡聚核苷酸純化柱純化；采用快速脫保護試劑，可在1h內完成堿基脫保護。

　　美國貝克曼公司01ig01000系列DNA合成儀

　　Olig01000系列采用星型射流設計，可節(jié)省試劑用量達50％；可自由選擇30、200和1000nmol合成量；每個循環(huán)只需2min，裂解／脫保護步驟所需時間短，可在1h內合成約17個堿基的引物；堿基試劑采用防潮雙元包裝，能迅速無誤稀釋核苷酸，具有良好的偶聯(lián)效率；儀器配有自動監(jiān)控系統(tǒng)，保證DNA準確合成；合成產物純度較高，無需純化，可直接應用于大多數的研究。

　　現(xiàn)在國內比較常見的高通量DNA合成儀是ABI3900，MM192和OLIGO192，前者一次可合成48條，后二者一次可以合成192條。

發(fā)展

　　當前DNA合成儀的主要生產廠商都致力于機器性能的完善和應用領域的開拓以及率、高產率的儀器的開發(fā)與研究。

　　中國臺灣科學委員會“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計劃”中的基因生物技術組已經成功研發(fā)**臺高密度復制DNA合成儀，可以同時合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應裝置，大量復制各種基因，不但節(jié)省時間，也可節(jié)省大量人力，這部機器能復制動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。

　　由于人們所需要的大部分核酸的堿基對數量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的zui長核酸鏈的堿基對數量，因此還需要不斷改善合成工藝才能得到較長的核酸分子。

　　為了能夠在將來改變酶的結構，使其在工業(yè)上更有價值；改變蛋白質和多肽的結構，制備新藥物；并開拓有關人類疾病和遺傳調控的新領域，化學合成DNA在這一過程中將起關鍵性作用。根據不同化學方法研制的DNA合成儀也將不斷涌現(xiàn)，能夠突破現(xiàn)有核酸合成的堿基對數量限制，大量節(jié)省人力、物力、財力。

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