實(shí)驗(yàn)方法原理

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA pian段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。
 

實(shí)驗(yàn)材料

DNA樣品

試劑、試劑盒

[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶緩沖液、醋酸銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、過硫酸銨、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift結(jié)合緩沖液、溴酚藍(lán)

儀器、耗材

水浴鍋 PCR儀 離心機(jī) 電泳儀 電泳槽

實(shí)驗(yàn)步驟

一、探針的標(biāo)記

1.   如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

（1）待標(biāo)記探針 (1.75 pmol/微升) ：2微升。

（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。

（3）Nuclease-Free Water ：5微升。

（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。

（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。

（6）總體積 10微升

（7）按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

2.   使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。

3.   加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。

4.   再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。

5.  標(biāo)記好的探針立即使用，長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

二、 探針的純化

通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

1.  對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

2.   在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。

3.  在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

4.   在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

5.   加入100微升TE，*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。

三、EMSA 膠的配制

1.   準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺?/span>選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。

2.   按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。

（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。

重蒸水 16.2毫升。

（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。

（3）80% 甘油： 625微升。

（4）10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) ：150微升。

（5）TEMED ：10微升

3.  按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

四、EMSA結(jié)合反應(yīng)

1.   如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)

陰性對照反應(yīng)：

(1）Nuclease-Free Water ：7微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。

（4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。

（5）總體積 ：10微升。

樣品反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：5微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。

（4）標(biāo)記好的探針： 1微升。

（5）總體積： 10微升。

探針冷競爭反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。

（4）未標(biāo)記的探針： 1微升。

（5）標(biāo)記好的探針： 1微升。

（6）總體積 ：10微升。

突變探針的冷競爭反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。

（4）未標(biāo)記的突變探針： 1微升。

（5）標(biāo)記好的探針： 1微升。

（6）體積 ：10微升

Super-shift反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

（4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。

（5）標(biāo)記好的探針：1微升。

（6）總體積 ：10微升。

2.   按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。

3.   加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

五、 電泳分析

1.  用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。

2.   把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。

3.   按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。

4.   剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

5.  干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測。

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其他

一、常見問答

1.  什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)？

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA pian段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。

2.  實(shí)驗(yàn)中需要用到什么試劑？

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(tǒng)（a,b）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA 5'末端標(biāo)記系統(tǒng)，用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶ye（氯化鎂，氯化鈉，或氯hua鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。

3.  凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試劑？

Promega公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的一種陽性對照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液，和能作20次對照實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點(diǎn)的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競爭實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針。

4.  成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡單也很快速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應(yīng)總體積應(yīng)小（20μl）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5）， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9）， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。

5.  在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？

目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp），這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。

6.  用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。