在實(shí)驗(yàn)過程中，由于樣品的各種性質(zhì)差異，只有選擇了正確的離心方法，才能獲得預(yù)期的分離純化結(jié)果。常用的離心方法主要有差速離心法、密度梯度離心法。其中密度梯度離心法又可細(xì)分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心法。

離心方法——差速離心  
     

差速離心法 (differebtial velocity centrifugation method) 又稱離心力差分離法。原理是利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經(jīng)過多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實(shí)現(xiàn)離心分離。如果分離樣品中有大中小三種不同粒徑的微粒，對它們施以不同的離心力，大粒徑的微粒，其質(zhì)量較大，首先沉降。分離上清液，以更大轉(zhuǎn)速對上清液進(jìn)行第二次離心，中顆粒被分離出來。再取上清以更大離心力，更高的轉(zhuǎn)速，后沉降小顆粒，以達(dá)到不同顆粒的分離，如圖 1 所示。由于在每種顆粒的沉淀物中總含有部分次級顆粒，如想將某種顆粒提純，需對該顆粒的沉淀物進(jìn)行稀釋后再離心沉淀，終可制備出理想純度的顆粒。

圖 1 差速離心
 

由于小粒徑的微粒質(zhì)量小，分離時(shí)所需離心力大。為滿足大離心力的需要，必需提高其旋轉(zhuǎn)速度，方可分離。以不同的離心力分離不同粒徑的微粒是動(dòng)力學(xué)的分離方法。特別是沉降速度差別較大的微粒多采用此種分離方法。差速離心原理可用離心力表達(dá)式說明。F=ma 其中 a=ω²R

差速離心主要用于分離直徑和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優(yōu)點(diǎn)是分離時(shí)間短、重復(fù)性高，樣品處理量大，可用于大量樣品的初分離。其缺點(diǎn)是分離復(fù)雜樣品和要求分離純度較高時(shí)，離心次數(shù)多，操作繁雜。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中間損失，所以離心分辨力差。實(shí)際分離時(shí)由于離心時(shí)的對流、擴(kuò)散和收取沉淀時(shí)的污染，對于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無法進(jìn)行*的分離提純。樣品的純度和回收率都不理想，因此差速離心法主要用于大量樣品的初步分離提純。
 

例如，我們可以對動(dòng)物肝組織勻漿液進(jìn)行多次的不同相對離心力和時(shí)間的離心和沉淀/上清分步收集，得到樣品的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和核糖體等的初步分離富集沉淀，用于下一步的其他檢測或者精細(xì)純化實(shí)驗(yàn)。具體的處理流程如下：

離心方法——速率區(qū)帶離心法

密度梯度離心（isodensity centrifugation method）又稱為區(qū)帶離心。離心時(shí)先將樣品溶液置于一個(gè)由惰性梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使樣品中幾種或全部組分分離，具有良好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純組分。缺點(diǎn)是離心時(shí)間較長，需制備梯度液，操作要求高。按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation method，R-Z）又稱連續(xù)密度梯度離心法和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method) 又稱不連續(xù)密度梯度離心法。

速率區(qū)帶離心也可稱為等區(qū)密度離心，是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進(jìn)行離心分離提純。離心時(shí)將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料，如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等形成的梯度液柱上面，樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點(diǎn)的密度，否則得不到理想的區(qū)帶離心效果。離心時(shí)，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶，選擇適合的轉(zhuǎn)速和時(shí)間進(jìn)行離心，當(dāng)各組分區(qū)帶距離拉得遠(yuǎn)時(shí)，結(jié)束離心，然后將區(qū)帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿足要求。優(yōu)點(diǎn)是一次分離純化，組分的沉降系數(shù)相差 20% 以上的即可選用此法，分辨力高，操作熟練可以將組分沉降系數(shù)相差 5%～10% 的樣品很好的分離。缺點(diǎn)是材料的條件限制，樣品液濃度不能太高，否則操作條件很難控制，同時(shí)此法與差速離心法相比，處理樣品的量要小的多。

圖 2 速率區(qū)帶離心
 

速率區(qū)帶離心的時(shí)間必須嚴(yán)格控制，不能太短，否則樣品區(qū)帶不清，時(shí)間也不能太長，否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決丁顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 2 所示。
 

速率區(qū)帶離心經(jīng)典的應(yīng)用就是通過蔗糖密度梯度離心，進(jìn)行各種亞細(xì)胞器（核糖體、線粒體、Exosome 等）和病毒顆粒（病毒載體、疫苗等）的純化。例如，我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀，經(jīng)過水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進(jìn)一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個(gè)亞基。具體的實(shí)驗(yàn)流程如下：

離心方法——等密度梯度離心法

等密度梯度離心也稱為平衡密度梯度離心。等密度梯度離心是根據(jù)樣品中各組分的浮力密度差不同進(jìn)行分離。在離心立場中，溶液中顆粒浮力密度小則上浮，浮力密度大則下沉，上浮和下沉的顆粒會一直延梯度液移動(dòng)到與其浮力密度恰好相等的位置上，該位置也稱顆粒的等密度點(diǎn)，離心時(shí)樣品各組分顆粒將按其密度大小分別移至等密度點(diǎn)形成區(qū)帶，形成的區(qū)帶不會因離心時(shí)間長而發(fā)生變化。離心后收集所需區(qū)帶顆粒即為純化組分。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 5-3 所示。

圖 3 等密度區(qū)帶離心
 

因此，在離心前，樣品可置于梯度液的任意位置，一般是均勻分布在梯度液中。等密度區(qū)帶離心法的離心效果取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越顯著，與樣品顆粒的大小與現(xiàn)狀無關(guān)。
 

速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心都需預(yù)準(zhǔn)備梯度液。速率區(qū)帶離心的梯度液密度必須小于待分離組分中小顆粒的浮力密度。利用顆粒形狀和大小差異而形成的沉降速率不同達(dá)到分離目的。等密度區(qū)帶離心是一種平衡離心方法，利用顆粒密度差進(jìn)行分離，與顆粒形狀和大小無關(guān)，處理量比差速離心法大。
 

等密度梯度離心經(jīng)常使用的梯度液包括氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等，典型的應(yīng)用包括質(zhì)粒 DNA（或者其他 DNA、RNA 核酸片段）的大規(guī)模高純度純化，脂蛋白的分離純化等。
 

質(zhì)粒 DNA 的氯化銫等密度梯度離心分離純化流程如下：

脂蛋白溴化鈉等密度梯度離心分離純化流程如下：
 

1) 人全血 1000 g 離心 10 分鐘去除各種血細(xì)胞，上清為血清。

2) 血清加入 NaBr 密度梯度液（不連續(xù)梯度）的底部，往上依次鋪濃度變小的梯度液。

3) 然后在水平轉(zhuǎn)頭中，260,000 g 離心力 14℃ 下離心 24 小時(shí)，各種密度的脂蛋白從管底浮向它們自己的等密度區(qū)形成了純的各種密度脂蛋白區(qū)。而離心管底部保留著各種血清蛋白。

4) 用上排法從離心管中抽出格層液體，經(jīng) DU 核酸蛋白分析儀測定，定位各種不同密度血清脂蛋白。