許多革蘭氏陰性細(xì)菌能產(chǎn)生出一套特定的N-acyl-L-homoserine-lactone（AHL）信號(hào)分子感應(yīng)為目的的一種手段,規(guī)范在cell-density-dependent協(xié)調(diào)基因表達(dá)方式。從acylated生產(chǎn)AHLs acyl-carrier蛋白（acyl-ACP）和S-adenosyl-L-methionine AHL合成酶的酶。具體的樣子AHLs由于大部份的固有的特異性酶acyl-ACP基質(zhì)的子集。Pantoea結(jié)構(gòu)的研究stewartii酶EsaI和AHL-sensitive生物測(cè)定法顯示,蘇氨酸140在酰基束縛的口袋里的指導(dǎo)酶對(duì)生產(chǎn)3-oxo-homoserine lactones。質(zhì)譜是用于檢查范圍的AHL產(chǎn)生的分子物種AHL合成酶下的各種條件。一個(gè)AHL選擇性分離純化的加法色譜純化的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)AHL deuterated緊隨其后的分別是液體reverse-phase chromatography-tandem質(zhì)譜,為了獲得相對(duì)量的估計(jì)不同的AHLs從生物樣品。生產(chǎn)的AHLs野生及工程EsaI AHL合成酶表明,卡和內(nèi)在的特異性和不同的細(xì)胞條件AHLs生產(chǎn)的影響。*百四定位在蘇氨酸的EsaI是很重要的偏愛(ài)3-oxo-acyl-ACPs,但其作用相當(dāng)于在卡蘇尚不清楚。此外,卡在大腸桿菌產(chǎn)生表示比例高的不尋常的AHLs由與酰基鏈奇數(shù)的碳。此外,這些研究提供額外的方法,將有助于對(duì)測(cè)量和全身AHLs從不同的來(lái)源。

許多革蘭氏陰性菌生產(chǎn)acyl-homoserine lactones（AHLs）細(xì)胞的一種信號(hào)被稱作感應(yīng)”,也就是一般相關(guān)的致病或公共的行為（回顧文獻(xiàn)39和64）。至少70多種細(xì)菌產(chǎn)生AHLs,而從分子鏈的長(zhǎng)度,C4植物酰醇C18。此外,AHLs可以有不同程度的非飽和在C-7或C-8位置,以及氧化在第三的位置（圖1）,（15,36歲）。大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生一個(gè)受限制的范圍,AHLs強(qiáng)耦合的選擇性AHL自己的檢測(cè)機(jī)械,利用轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機(jī)構(gòu),如我們所知的R-proteins的選擇性的結(jié)合,是AHL激活或抑制許多下游的靶基因（53 55歲60人）。這一明顯的耦合具有導(dǎo)致AHL生產(chǎn)的觀念,相對(duì)限制在物種信號(hào)有別于interspecies信號(hào)（21）。

內(nèi)在的專一是對(duì)AHL合成酶acyl-acyl為子集的載體蛋白（acyl-ACP）基體的重要因素AHLs生產(chǎn)特別。合成的細(xì)胞中AHLs由AHL合成酶酵素基質(zhì)是常見(jiàn)的組成部分,acyl-ACP細(xì)胞的新陳代謝,S-adenosyl-L-methionine（40條、第46條）。Pantoea stewartii酶的酶EsaI和銅綠假單胞菌3-oxo-C6-homoserine內(nèi)酯（生產(chǎn)優(yōu)先卡）,分別3-oxo-C12-HSL好舒（1、48）。這兩種酶結(jié)構(gòu)的研究顯示一種常見(jiàn)的結(jié)合進(jìn)行acyl-ACP phosphopantetheine假肢集團(tuán)、建模研究的一個(gè)特定的蘇氨酸與acyl-chain結(jié)合為作為一個(gè)重要的氫鍵的位置3-oxo acyl-ACP（17,62）。此外,比較AHL合成酶序列及其AHLs他們會(huì)產(chǎn)生建議蘇氨酸,在這一位置與生產(chǎn)3-oxo-HSLs,而丙氨酸和甘氨酸結(jié)合unsubstituted和色氨酸的AHLs與生產(chǎn)3-hydroxy-HSLs。AHLs產(chǎn)生的EsaI和蘇氨酸140-to-alanine替代變種生物被定義為使用兩個(gè)敏感的記者,展現(xiàn)一個(gè)戲劇性的轉(zhuǎn)變生產(chǎn)AHL在3-oxo-C6-HSL野生型郵寄）在C6-HSL變異（62）。盡管這化驗(yàn)證實(shí)殘留在作用,為3-oxo-acyl-ACP AHL合成酶特異性,真正的特異性不能使用這個(gè)AHL檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估。

能被探測(cè)到AHLs有效利用生物AHL-sensitive在溶液中或thin-layer-chromatography（TLC）覆蓋格式。薄層層析覆蓋化驗(yàn)被廣泛用于確定種類,所產(chǎn)生的AHLs特定細(xì)菌,或說(shuō)得更具體特定AHL合成酶,因而55）。這些生物分析是靈敏度高、檢測(cè)能力sub-picomole大量的特定的AHLs。不過(guò),有一個(gè)內(nèi)在檢測(cè)偏見(jiàn)、因?yàn)樗麄冎竿囟ǖ奶禺愋詾橛浾邞?yīng)變是用來(lái)檢測(cè)方面AHL Chromobacterium violaceum（37）,農(nóng)桿菌機(jī)理TraR）（55（綠膿桿菌）,或者LasR）（48）。在記者近期發(fā)展提供了一定的菌株相對(duì)混淆檢測(cè)系統(tǒng)是認(rèn)識(shí)更為廣泛的AHLs（49,66歲）。然而,對(duì)已知的*的范圍AHLs、多記者株必須裝備全套的標(biāo)準(zhǔn),來(lái)評(píng)定哪些點(diǎn)對(duì)應(yīng)各具體的信號(hào)（7）。

質(zhì)譜（MS）和氣相色譜AHL -MS提供替代方法的檢測(cè),該結(jié)果是基于物理/化學(xué)性能的化合物,如大眾/費(fèi)用比collisionally誘導(dǎo)分子離子,產(chǎn)品離子、和色譜保留性質(zhì)。Derivatization已經(jīng)被使用了AHLs的星座考試3-oxo-HSLs用氣相色譜-質(zhì)譜（8）。直接分析已經(jīng)被報(bào)道AHLs采用氣相色譜-質(zhì)譜（6）和液相色譜（HPLC）耦合離子阱質(zhì)譜（質(zhì)）（36,41 15,17,43,44,48,59歲）。增加了一個(gè)預(yù)濃縮措施已經(jīng)被報(bào)道的高度敏感的結(jié)果,在AHL檢測(cè)的方法（13、14）。

作者描述的方法結(jié)合起來(lái)的一種顯示AHLs變化與突變的分布引入兩個(gè)AHL合成酶,EsaI和卡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)AHLs分布的液體chromatography-electrospray取決于標(biāo)本ionization-tandem質(zhì)譜（LC / MS / MS）triple-quadrupole質(zhì)譜儀使用。我們研究了活性部位的影響的threonines EsaI和卡的特異性的綜合,以及AHL貢獻(xiàn)目的語(yǔ)文化背景知識(shí)的不同的細(xì)菌產(chǎn)生的各種各樣的AHLs這些AHL合成酶體內(nèi)。

材料和方法

AHL術(shù)語(yǔ)。簡(jiǎn)短起見(jiàn),一個(gè)?；溡粋€(gè)具體的長(zhǎng)度是由等號(hào)前“Cn”為數(shù)量的碳在鏈條,而不是化學(xué)名（即是hexanoyl C6）,和替代類型和職位或3-oxo 3-hydroxy（如3-oxo-C6-HSL）。D3表明,AHL包含三個(gè)氘原子的位置在終端?；湣?/p>

D3-C6-homoserine內(nèi)酯的合成。固相carbodiimide,可用于合成化學(xué)D3-C6-HSL,使用N-cyclohexylcarbodiimide-N的-propyloxymethyl聚苯乙烯樹脂（PS-carbodiimide;Argonaut技術(shù)）（12,45）。脂肪酸D3-hexanoic酸（34.5μmol[第4.11章毫克]）（劍橋同位素400加入二氯甲烷的μl（以10%的氮、N-dimethylformamide）在另一個(gè)玻璃反應(yīng)小瓶里。這種反應(yīng)瓶,40毫克的PS-carbodiimide和混合氣添加了點(diǎn)5分鐘室溫。脂肪酸后,以平衡被允許與樹脂的,4.2個(gè)毫克（23μmol）——-amino butyrolactone溴酸右美沙芬（HSL-HBr）（奧爾德里奇）溶解在200μl以10%的氮、N-dimethylformamide和4.6μmol 6.4μl）（triethylamine（隨后的分析顯示沒(méi)有顯著lactonolysis產(chǎn)品時(shí)使用triethylamine為基礎(chǔ)[數(shù)據(jù)未顯示）,攪拌加入30小時(shí)室溫。反應(yīng)包括檢查resin-bound基質(zhì)中濾除耦合/中介,固相萃取如下所述為AHL提取物。D3-C6-HSL的產(chǎn)品是resuspendedzui后在甲醇濃度的200μM。這稀釋,體現(xiàn)LC / MS相當(dāng)于0.2 nmol C6-HSL的,用于所有剩下的實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖4B）。

誘變的LasIG質(zhì)粒。撰寫LasIG替換是由pLasIG使用QuikChange誘變方法（Stratagene）為每一個(gè)突變互補(bǔ)底漆顯示在表1。這些突變經(jīng)限制,如果可能,分析消化和DNA測(cè)序整個(gè)基因。

acyl-homoserine lactones的提取和純化為質(zhì)譜分析。大腸桿菌株（表1）,而為AHL質(zhì)粒表達(dá)stewartii從第EsaI合成酶和pLasI和pLasIG從銅綠假單胞（18支全壘打,61）,種植在5-ml文化在Luria-Bertani（磅）湯μg / ml的100°C孕37氨芐戰(zhàn)兢12到16小時(shí)。每一種文化都是1稀釋到10毫升的新鮮磅湯100μg / ml氨芐西林和孵化到細(xì)胞密度達(dá)到一種密度的600海里（OD600 0.6 - 0.8。溫度降至25°C,持續(xù)15分鐘,經(jīng)過(guò)equilibration,每一種文化都引起增加IPTG（異丙——D-thiogalactopyranoside）0.5毫米。培養(yǎng)是孵化為25°C 6 ~ 8小時(shí)搖和法。文化的銅綠假單胞種植在同樣的方式,除了應(yīng)變PAO1 PAO214并不需要抗生素和應(yīng)變與pEX30-las 500μg / ml carbenicillin要求。文化進(jìn)行處理supernatants在離心10分鐘x 3200號(hào),其次是decanting成一個(gè)20-ml注射器,通過(guò)一個(gè)0.2-μm過(guò)濾器。在尚未準(zhǔn)備樣品的定量分析,nmol由0.4添加D3-C6-HSL每10毫升的文化上清收獲后但在過(guò)濾。提取的文化supernatants兩次10毫升的酸性,乙酸乙酯（0.1毫升/升醋酸）,和9個(gè)曼梯·里從每個(gè)萃取是混合的了,2-ml*干燥在玻璃樣品瓶。這提取時(shí)間、提取預(yù)計(jì)至少75%的3-oxo-C6-HSLs。AHLs也取得商業(yè)來(lái)源（σ,公司法定人數(shù)科學(xué)）。

初始凈化AHL分子物種被了固相萃取。每份樣品redissolved,在100μl甲醇（*解,西格瑪）,應(yīng)用于9月啟動(dòng)Pak加上硅墨盒（水,都配有一個(gè)6-ml玻璃反應(yīng)瓶、附在真空在靜聽(tīng)著的松林之間。模組,已經(jīng)被活化6毫升的連續(xù)油水各溶劑在以下序列:平等的大量的isooctane和乙醚（乙醚防腐劑不得有簡(jiǎn)單有效,看成分蠻清爽）,酸性,isooctane乙酸乙酯和乙醚。樣品,在甲醇溶劑中添加到5毫升isooctane-ethyl醚,pipetted入反應(yīng)瓶、然后裝到SPE墨盒。固相萃取的洗了兩次筒6毫升的isooctane-ether然后eluted到進(jìn)玻璃杯分?jǐn)?shù)管5 - 8毫升的酸性乙酸乙酯。經(jīng)過(guò)凈化的樣品被送往干燥采用真空制鹽附近,然后移交給一個(gè)玻璃autosampler瓶是蒸發(fā)*。在redissolved樣本50年或100μl甲醇和限定。

/環(huán)己烷可以使用的地方isooctane作為溶劑凈化手術(shù),但是雜質(zhì)含量/環(huán)己烷reagent-grade了電噴霧離子m / z 284和228個(gè)在AHL分析。因此,prepurified /環(huán)己烷是在固相萃取才能通過(guò)筒之前被用于凈化AHLs細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量。真正的AHLs是被LC / MS / MS在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）實(shí)驗(yàn),當(dāng)基因轉(zhuǎn)移從母體離子兩?；蛢?nèi)酯基重疊峰相比,與已知標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)色譜保留時(shí)間。停留時(shí)間分析方法能夠區(qū)分出C（n）-HSL和3-oxo-C（n-1）-HSL分子物種,也有類似的群眾（數(shù)據(jù)未顯示）。

LasR記者的分析方法。LasR記者應(yīng)變大腸桿菌的MG4 / pKDT17a（48歲,52）是一夜之間就在一個(gè)中號(hào)（52）,以1毫米MgSO4和100μg / ml氨芐西林30°C。每個(gè)萃取1毫升的稀釋產(chǎn)業(yè)文化（增加到一個(gè)OD600 0.1）的5到6小時(shí)30°C。威爾森說(shuō)︰樣本來(lái)分析-galactosidase活動(dòng)所使用磨房主分析法（16,38）。

液相色譜。樣本LC / MS和LC / MS / MS分析在100 resuspendedμl甲醇和10μl在注射2.0-mm reverse-phase由150.0-mm哥倫布C18柱（Phenomenex）操作在流量達(dá)到200μl /分鐘廢水直接進(jìn)入質(zhì)譜儀流動(dòng)。溶劑一個(gè)由水含有0.1%冰醋酸B、溶劑組成的甲醇冰醋酸含有0.1%。一個(gè)梯度洗脫方法在5%開(kāi)始利用溶劑在五分鐘,到95%的溶劑B超過(guò)30分鐘,仍然在95%等靜溶劑B,持續(xù)15分鐘。reequilibrated柱是5分,一個(gè)空白的zui終被相互之間進(jìn)行分析。這梯度優(yōu)化broad-range檢測(cè)是降低zui初的有機(jī)濃度的制度,但它可以輕易被調(diào)整,使之更好的獨(dú)立,longer-acyl-chain都AHLs短。

質(zhì)譜法。光譜分析質(zhì)量進(jìn)行了API-3000體育Sciex triple-quadrupole串聯(lián)質(zhì)譜（Perkin-Elmer生命科學(xué)、特霍西爾,安大略,加拿大）。ion-scanning實(shí)驗(yàn)前兆進(jìn)行第三positive-ion模式設(shè)置為顯示器的m / z此類證券就達(dá)到1022和*集掃描大量范圍的m / z 50到m / z 400 5秒。該儀器參數(shù)如下:離子噴霧電壓為4200 V,declustering潛力的潛力,以50 V碰撞200 V,氮是25五、作為碰撞氣體。

多個(gè)反應(yīng)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)研究了使用相同的液相色譜條件和邁克爾-舒馬赫參數(shù)前所述。離子的*節(jié)和第三監(jiān)測(cè)顯示在表2是為每個(gè)AHL。這些離子過(guò)渡與從母體離子的每一個(gè)都AHL基酰[M + H-101]+,以及內(nèi)酯基在M / z 102（圖磅）對(duì)于每一種AHLs標(biāo)識(shí)在不斷的前兆ion-scanning實(shí)驗(yàn),以及其他AHLs預(yù)測(cè)要出席。

AHLs的定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了1-mg / ml股票解AHLs以下各位在甲醇溶劑中:3-oxo-C6-HSL（西格瑪）,C6-HSL（Fluka）,C12-HSL（Fluka）。股票解決方案（包括5毫米）,在甲醇產(chǎn)量增加到連續(xù)1000,200,濃度40歲,8個(gè),1.6μM。對(duì)于每一種分,10μl標(biāo)準(zhǔn)曲線各稀釋是加到一autosampler每小瓶含0.4 nmol D3-C6-HSL內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的甲醇。標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品MRM使用相同的液相色譜條件和儀器前述參數(shù)。測(cè)物的峰面積結(jié)合使用定量分析軟件（Perkin-Elmer 1.2;）。相比產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比率分析物的區(qū)域的山峰和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品量之比分析物的每個(gè)標(biāo)本中的和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)結(jié)果）。每個(gè)綜合高峰是手動(dòng),檢查,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化到內(nèi)標(biāo)峰的地區(qū)。

結(jié)果

想了解AHL合成酶達(dá)到這樣的高的特異性在AHL信號(hào)產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中所扮演的角色,我們檢測(cè)了EsaI和threonines*百四蘇卡、144 142比較的AHL野生產(chǎn)品和突變的酶。AHL合成酶活性的測(cè)定內(nèi)在特異性就利用不同的acyl-ACPs為基體的親和力、公里需要測(cè)量值的范圍廣泛的acyl-ACPs。不僅是難以作出足夠數(shù)量的acyl-ACPs進(jìn)行這類學(xué)習(xí)（26,32歲）,但是它也會(huì)有必要了解身份工作,而且還要能夠自己作出所有相關(guān)的AHLs。雖然AHLs可以進(jìn)行使用常用的記者應(yīng)變生物傳感器、整體的分析需要多個(gè)記者品種和眾多的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)和確認(rèn)許多不同的AHLs。此外,記者株存有偏見(jiàn)為某一特定范圍的酰鏈以及替代在第三的位置。從而更快速、less-biased分析AHL合成酶特異性比可以達(dá)成以凈化acyl-ACPs或AHL記者生物測(cè)定法,我們用質(zhì)譜研究范圍的AHLs由各酶表達(dá)了大腸桿菌在多種情況下。

從AHLs的凈化質(zhì)量。分析了產(chǎn)生的AHLs本國(guó)或突變也AHL合成酶,這是必須先把信號(hào)由這些酶。生產(chǎn)的AHLs革蘭氏陰性菌分享homoserine內(nèi)酯環(huán)和容易彌漫或出口的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)上清（30）。由于其固有的特性,AHLs提取細(xì)胞培養(yǎng)等有機(jī)溶劑上清乙酸乙酯（37）。減輕作業(yè)量?jī)?nèi)酯水解及隨后的儲(chǔ)存在檢查,乙酸乙酯輕微被加上了酸性0.1毫升/升醋酸前55歲,提取65）。另外,AHLs與其他可提取溶劑,如二氯甲烷,這可以提取3-oxo和更有效的3-hydroxy-HSLs比乙酸乙酯、或AHLs獲得完整細(xì)胞利用卜萊的提取工藝和戴爾脂質(zhì)（2）?；衔锏幕旌衔锏挠嘘P(guān)分子量在這兩種情況下是很復(fù)雜的,它有幫助凈化AHLs污染的油脂和小分子。

固相萃取分離純化的條件下能分離AHLs雜質(zhì)基于一種普遍的化學(xué)結(jié)構(gòu),極地的性質(zhì)的homoserine內(nèi)酯的戒指。發(fā)展的商業(yè)AHLs凈化協(xié)議用乙酸乙酯提取物的大腸桿菌supernatants從細(xì)胞表達(dá)文化AHL合成酶的酶。薄層色譜分離純化的優(yōu)化分析方法對(duì)固相萃取溶劑系統(tǒng),3-oxo-C12-HSL純化3-oxo-C6-HSL乙酸乙酯萃取物,100-ml的LasIG文化。LasR記者的生物被用來(lái)跟蹤洗脫的信號(hào),AHL,如圖2。乙酸乙酯洗脫已恢復(fù)輸入信號(hào),這是滿足這一分析的,因?yàn)橐粋€(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)能糾正任何損失從生產(chǎn),不能再進(jìn)一步的重大損失AHL已見(jiàn)用固相萃取技術(shù)的清洗步驟。這個(gè)過(guò)程消除了之前需要完成薄層色譜分析質(zhì)量,減少了光譜分析樣品的復(fù)雜性,要檢查AHLs集中。