ELISA試劑盒檢測體系可謂是免疫學反響應用到科研出產(chǎn)中zui為活絡的技術(shù)手段。但是在新老手操作過程中總是會呈現(xiàn)或大或小的問題，比如說花板，假陽性，全顯色，悉數(shù)顯色，顯色比空白還低.....。江萊生物為您總結(jié)7步ELISA檢測實驗經(jīng)歷，做好這7步您就能得出的實驗成果。
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其辨認，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴厲正告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，關(guān)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，辦法簡要的列出如下:
①親和素生物素:先親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被辦法均勻、結(jié)實，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精蒸發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相外表。
③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、ELISA試劑盒包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于實驗的需求，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應留意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體外表的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體外表。詳細的實驗還要有鞏固的理論外也要實踐，看一下終究可不可以應用到自己實驗當中去。常用的包被液除了剛才說到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、關(guān)閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。關(guān)閉就是讓許多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，從而排斥ELISA后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用關(guān)閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度運用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除相似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用什么，要依據(jù)實驗詳細來實踐。
4、洗刷板：可以說在ELISA操作中，洗刷是zui首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為到達別離游離的和結(jié)合的酶符號物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì)，在洗刷時又應把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯，人為因素很大(當然有條件的用洗板機在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡的ELISA體系但是不小的影響。
5、加抗體標本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用PBS稀釋，也可用關(guān)閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太低則上色淺。
6、顯色：顯色體系又許多，我們一開始做的時分，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
7、ELISA試劑盒每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如呈現(xiàn)問題也好剖析。