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酶聯(lián)免疫吸附法（EIASA）測(cè)定克倫特羅殘留2

來源：上海銳谷生物科技有限公司 2011年01月08日 10:11

（1）試劑和材料以下所有試劑，除特別注明外，均為分析純?cè)噭凰疄榉螱B／T6682規(guī)定的二級(jí)水。

①鹽酸克倫特羅對(duì)照品：含鹽酸克倫特羅不得少于98．5％

②鹽酸

③無水甲醇

④氫氧化鈉

⑤磷酸二氫鉀

⑥磷酸

⑦鹽酸溶液取鹽酸4．2ml，加水至1000ml，即得。

⑧o．5mol／L磷酸二氫鉀溶液取磷酸二氫鉀68g，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．O，用水稀釋至1000ml，即得。

⑨0．05mol幾磷酸二氫鉀溶液取磷酸二氫鉀6．88，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．0，用水稀釋至1000mi，即得。

a．氫氧化鈉溶液取氫氧化鈉48，加水使溶解成100mi，即得。

b．鹽酸克倫特羅對(duì)照品儲(chǔ)備液（1mg／mi）準(zhǔn)確稱取28．3mg鹽酸克倫特羅對(duì)照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。

⑩鹽酸克倫特羅對(duì)照品工作液（10ttg／mi）取lmg／mi儲(chǔ)備液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1個(gè)月。

⑾鹽酸克倫特羅對(duì)照溶液（100ng／m1）取1（ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1個(gè)月。

⑿鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒（2～8~C冰箱中保存）

⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

（2）儀器和設(shè)備

①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀

②分析天平精度0．00001g

③天平精度0．01g

④冷凍離心機(jī)

⑤50mi具塞離心管

⑥勻漿機(jī)

⑦微型振蕩器

⑧回旋振蕩器

⑨微量移液器單道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，

⑩干熱濃縮器

①空氣壓縮機(jī)

（3）測(cè)定步驟

①試料的制備（尿）

取供試尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為供試試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。

取空白尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為空白試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。

取空白尿2ml，于3000r／min離心lOmin，上清液1．Oml添加lOOug／L的克倫特羅對(duì)照溶液20／H。作為2ug/l空白添加試料，直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。

②試料的制備（肝）

取約lOOg新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機(jī)以10000r／rain勻漿1-2min，使均勻呈糊狀，一20~C以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/div>

取均漿后的供試肝樣，作為供試試料。

取均漿后的空白肝樣，作為空白試料。

取均漿后的空白肝樣（1土0．05）e添加lOOng／m1的克倫特羅對(duì)照溶液20tzL作為2ng／g空白添加試料。

a：提?。ǜ危?nbsp; 取（1士o．05）z試料，置50ml離心管中；加鹽酸溶液5．Omi，旋渦混勻，中速振蕩1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度離心15min；上清液移人另一50ml離心管中，加入氫氧化鈉溶液300gL，混勻，振蕩15min；加o．5mol／l磷酸二氫鉀溶液4．Omi，混勻，2—8~C放置過夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度離心15min，上清液備用。

b．凈化（肝） C，，固相萃取柱依次用無水甲醇3mi、o．05mol／L磷酸二氫鉀溶液2mi預(yù)洗，不使柱床干涸；將備用上清液全部過柱；用o．05mol／L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗，擠干，棄去所有淋洗液；用無水甲醇2mi洗脫，流速控制在o．5ml／mm以下，擠干，收集洗脫液；于50～60~C下用氮?dú)饣蚩諝饩従彺蹈上疵撘海粴堄辔镉盟?．Omi溶解，以4000r／mill以上的速度離心15rain，清液作為試樣溶液供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。

③測(cè)定

a．室溫應(yīng)控制在19～30~C。

b．取在19—30~C放置1—2h的試劑盒，按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計(jì)算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量，插入框架。每個(gè)微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL，封口膜封板，室溫孵育30min。

c倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯(lián)板的微?L內(nèi)，稍后倒出孔內(nèi)液體，再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，如此重復(fù)操作洗板3次。

d．分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL，分別放入不同微孔底中央，并在每孔內(nèi)加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結(jié)合物100~I。，在微型振蕩器上混勻，用封口膜封好，室溫孵育30min。

e．倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒有殘余液體，重復(fù)洗板3次。

f．用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL，室溫避光孵育15min。

g．用多道移液器每孔加終止液100uL。

h．在1h內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi)，于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

（4）計(jì)算用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出試料中克倫特羅的含量。

（5）靈敏度和回收率

本方法的平均檢測(cè)下限為o，ibg／k8。

本方法在1Ps／kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60％一120％，豬肝回收率范圍為40％～120％。

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