重現(xiàn)性差代表液相色譜故障了？

    重現(xiàn)性差是液相色譜分析中出現(xiàn)故障的一個(gè)準(zhǔn)確信號(hào)，首先在分析那些滿足系統(tǒng)適配性的樣品時(shí)出現(xiàn)的問題，分析工作者使用這些樣品測(cè)定時(shí)，液相色譜方法及其系統(tǒng)能否很好的工作？其次，測(cè)得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測(cè)量誤差比較起來是否相差很大？

    重現(xiàn)性差是液相色譜分析中出現(xiàn)故障的一個(gè)準(zhǔn)確信號(hào)，首先在分析那些滿足系統(tǒng)適配性的樣品時(shí)出現(xiàn)的問題，分析工作者使用這些樣品測(cè)定時(shí)，液相色譜方法及其系統(tǒng)能否很好的工作？其次，測(cè)得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測(cè)量誤差比較起來是否相差很大？

zui后，當(dāng)空白樣品基體與已知樣品進(jìn)行比較表現(xiàn)出不同時(shí)如何判別？都是需要解決的問題！

           系統(tǒng)適配性分析試驗(yàn)中的奇怪的譜圖

 問題

用我的方法進(jìn)行系統(tǒng)適配性樣品性能試驗(yàn)時(shí)遇到了費(fèi)解的問題。 我分析測(cè)定了儲(chǔ)存于不同強(qiáng)制條件下樣品的穩(wěn)定性。我將所有的標(biāo)準(zhǔn)品都制成同一溶液并立即冷凍在--78℃溫度下 。每隔一段時(shí)間取出 3小瓶做系統(tǒng)適配性分析試驗(yàn)，取另一小瓶作為校準(zhǔn)標(biāo)樣.每一小瓶中都配有一個(gè)分析物和一個(gè)內(nèi)標(biāo)物。

系統(tǒng)適配性試驗(yàn)需要從每個(gè)系統(tǒng)適配性標(biāo)樣小瓶中取出一份，進(jìn)行3次進(jìn)樣。該法要求保留時(shí)間的重現(xiàn)性以及分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（ 響應(yīng)因子）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在一定的范圍之內(nèi)。

我用該法在zui后兩次測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)了奇怪的色譜圖形。 在所有情況下， 前兩個(gè)小瓶進(jìn)樣的響應(yīng)值相同，但第3個(gè)小瓶進(jìn)樣的峰面積明顯變小。在每個(gè)小瓶中， 峰面積是恒定的， 所有進(jìn)樣的保留時(shí)間是相同的，而且響應(yīng)因子的 RSD是良好的 。這個(gè)分析是滿足系統(tǒng)適配性要求的， 后來對(duì)強(qiáng)制樣品的分析也都得出所期待的結(jié)果。 *奇怪的問題是，系統(tǒng)適配性

進(jìn)樣的第 3 個(gè)小瓶的峰面積響應(yīng)出現(xiàn)階躍變化，這是怎樣產(chǎn)生的？

 解答

峰面積之所以下降，是由兩個(gè)原因之一引起的——或者進(jìn)樣體積減小，或者樣品濃度變低。 可利用內(nèi)標(biāo)來補(bǔ)償進(jìn)樣體積的變化或預(yù)處理時(shí)的樣品損失。內(nèi)標(biāo)正確地補(bǔ)償了這些變化，得出的結(jié)果就能令人滿意。

首先，讓我們?cè)僮鰩状卧囼?yàn)以考察與標(biāo)樣有關(guān)的潛在問題，例如， 究竟是3號(hào)小瓶的內(nèi)容物有問題， 還是它所處的位置或進(jìn)樣順序有問題。若仍有標(biāo)樣，應(yīng)按第1次3個(gè)小瓶的順序重新進(jìn)樣，并觀察是否出現(xiàn)相同的現(xiàn)象。 然后重新安排這 3個(gè)小瓶的進(jìn)樣順序（ 例如改成 2號(hào)、 3號(hào)、1號(hào)的順序），觀察究竟是小瓶內(nèi)容物還是進(jìn)樣順序引起了峰響應(yīng)的改變。

若因稀釋錯(cuò)誤使 3 號(hào)小瓶內(nèi)所裝的分析物和內(nèi)標(biāo)物濃度變低， 則峰面積應(yīng)該下降，但響應(yīng)因子應(yīng)該相同。 濃度低的可能性很小， 因?yàn)樗行∑恐械臉悠范际窃谕粫r(shí)間制備并儲(chǔ)存在相同條件下的。重新檢查這些系統(tǒng)適配性標(biāo)樣的制備過程，可能會(huì)揭示出問題的根源。

若低響應(yīng)是由小瓶的位置而不是由于裝瓶時(shí)樣品濃度不同所致，則問題的出現(xiàn)可能是由自動(dòng)進(jìn)樣器或色譜柱的填充狀況變化造成的。這種可能性可以通過第 3次進(jìn)樣后將前兩個(gè)小瓶中的樣品重新進(jìn)樣來檢查。若響應(yīng)仍然很低，應(yīng)該考慮邏輯線路方面的問題。若響應(yīng)回到正常值，就將第3個(gè)小瓶樣品再重新進(jìn)樣一次。

根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)填充情況的變化不是像你觀察到的階躍變化， 而是一個(gè)漸變的過程。 例如，由于在柱內(nèi)硅醇基與堿性官能團(tuán)之間的相互作用使分析物的峰產(chǎn)生嚴(yán)重拖尾。有時(shí)在正常濃度或高濃度情況下 ，進(jìn)幾次標(biāo)樣能使硅醇基失活， 并可改善下幾次進(jìn)樣的峰形 。同樣，若系統(tǒng)中某一部位還在吸附樣品，就必須在獲得正常響應(yīng)之前進(jìn)幾次樣 ? 使活性部

位飽和。無論如何，在這種情況下，流出圖上的峰面積是逐漸增大而不是逐步減小的，因此我并不認(rèn)為這種解釋是適合于現(xiàn)有問題的。

我猜想自動(dòng)進(jìn)樣器的第 3個(gè)位置可能出了毛病。如果發(fā)生了這種情況，以后的工作就應(yīng)該避開那個(gè)位置。同時(shí)也要仔細(xì)檢查控制程序， 以確保對(duì)第 3個(gè)小瓶的較少進(jìn)樣不給出指令。這兩個(gè)問題也可以通過使用其它方法用另一個(gè)標(biāo)樣來檢查，例如，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用色譜柱試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)試，就能排除任何與方法有關(guān)的化學(xué)問題，而把問題集中在機(jī)械或電子學(xué)方面。

在這里，沒有給出任何明確的答案。通過仔細(xì)研究，尋找峰面積響應(yīng)趨勢(shì)的數(shù)據(jù)，尤其是分析物和內(nèi)標(biāo)物的數(shù)據(jù)， 就有可能發(fā)現(xiàn)問題。

峰面積的重現(xiàn)性很差

問題

用我的方法給出的峰面積的重現(xiàn)性很差。 保留時(shí)間很好，但峰面積的 RSD 已達(dá) 5%~10%，可我常見到的只有 1%~2%。 我在這個(gè)與出現(xiàn)問題有關(guān)的系統(tǒng)中什么都沒有改動(dòng)。這個(gè)系統(tǒng)由一個(gè)低壓混合系統(tǒng) 、一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器、一個(gè)C8色譜柱和一個(gè)UV 檢測(cè)器組成。等度洗脫的流動(dòng)相在線混合，流動(dòng)相為PH3 的磷酸緩沖液和甲醇。

解答

峰面積的重現(xiàn)性依賴于自動(dòng)進(jìn)樣器操作的一致性。所以我認(rèn)為這就是你的問題的根源。首先，應(yīng)盡量保持進(jìn)樣的始終如一。 通過進(jìn)已知標(biāo)樣的相同樣品zui容易查出主要原因，問題可能就出在樣品瓶上。

樣品必須是均勻的。高鹽濃度的樣品基體容易分層，冷凍時(shí)會(huì)混合不勻 。萬一有分層存在， 就要來回?fù)u動(dòng)樣品瓶? 使瓶中內(nèi)容物混合均勻。樣品瓶太滿、 密封太緊可以產(chǎn)生不同的結(jié)果。

吸樣時(shí)， 樣品瓶中形成一定真空，造成吸樣困難。這種條件就造成了進(jìn)樣量的差異。通常瓶中內(nèi)容物不超過總?cè)莘e的 1/2~3/4為*。

如果樣品溶劑容易揮發(fā)， 那么樣品瓶密封不良也能出現(xiàn)問題。 樣品溶劑的蒸發(fā)損失可以導(dǎo)致每次進(jìn)樣的樣品濃度不同。

滯留在自動(dòng)進(jìn)樣器針頭里的樣品瓶隔膜小片移動(dòng)時(shí)， 能起到開合的擋板作用 。這種情況可產(chǎn)生不良的重現(xiàn)性， 或者地說， *不能進(jìn)樣。 懷疑阻塞時(shí)可以沖洗進(jìn)樣管和進(jìn)樣針頭， 用針頭捅絲清除異物，或者更換新針頭。 使用不能被針頭穿切出小片的硅橡膠樣品瓶隔膜。 貼面的隔膜似乎比別的材料更不容易被穿切出小片。

不適當(dāng)?shù)厥褂米⑸淦骱腿友b置更容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問題 。 例如，在我的實(shí)驗(yàn)室中把一些自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)計(jì)成通過很長細(xì)內(nèi)徑的塑料管把樣品從樣品瓶轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣閥中，如果這個(gè)輸送管中有氣泡， 它們遇到阻力變化時(shí)會(huì)膨脹或收縮， 導(dǎo)致從樣品瓶中吸取樣品量的變化。 為了防止這一情況發(fā)生， 分析工作者在使用前應(yīng)將溶劑*脫氣并清洗進(jìn)樣管。有些自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)是根據(jù)所要求的進(jìn)樣體積而使用不同規(guī)格的注射器 。

若注射器與樣品量失配， 動(dòng)作位置的失誤會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的誤差， 因此要注意檢查安裝的注射器是否適當(dāng)。若設(shè)計(jì)的自動(dòng)進(jìn)樣器是從樣品瓶吸取樣品再傳送到進(jìn)樣閥， 則問題可能出在進(jìn)樣閥上。 樣品針頭在進(jìn)樣口處必須密封良好， 否則樣品會(huì)泄露損失。 應(yīng)該調(diào)整或更換進(jìn)樣針頭的密封圈以防泄漏 。

流路上的任何阻力都能產(chǎn)生反壓， 造成進(jìn)樣針頭周圍泄漏。 應(yīng)檢查進(jìn)樣閥的每條通路， 尤其要保證廢液導(dǎo)管暢通。否則， 樣品溶液和緩沖液的蒸發(fā)會(huì)留下殘?jiān)?nbsp;逐漸堵塞廢液導(dǎo)管。對(duì)進(jìn)樣閥組裝不正也能產(chǎn)生反壓， 使樣品針頭的密封圈泄漏。進(jìn)樣方式能影響峰面積的重現(xiàn)性，但自動(dòng)進(jìn)樣要好于手動(dòng)進(jìn)樣。 由于流體流動(dòng)的特性，在定量管全充滿情況下，當(dāng)樣品量至少為定量管體積的二三倍時(shí)，會(huì)產(chǎn)生精度的zui高等級(jí)；而在定量管半充滿情況下， 當(dāng)樣品量少于定量管體積的一半時(shí)， 精度zui高。 由于這個(gè)原因，你應(yīng)該從兩個(gè)方面來檢查， 即不僅要檢查是否把合適的定量管安裝在自動(dòng)進(jìn)樣器上， 而且還要檢查進(jìn)樣體積是否與所要求的精度等級(jí)相一致。

泄露也能影響峰面積精度，但泄露產(chǎn)生的問題與保留時(shí)間變小相似，因此這個(gè)情況不大可能成為你的問題的根源。這樣，你可以領(lǐng)悟到進(jìn)樣精度問題有很多可能的原因。 我一開始就想仔細(xì)考察所有系統(tǒng)的設(shè)置，以保證你不出現(xiàn)誤差，然后全面考慮上面列舉的全部可能性， 看它們當(dāng)中是否有一個(gè)是問題的主要原因。

一次只改變一種可能性， 你就會(huì)找出問題的真正根源 。這個(gè)方法能幫助你懂得今后怎樣避免出現(xiàn)相同的問題。

進(jìn)一個(gè)基體空白樣品時(shí)會(huì)遇到的高壓問題

問題

有時(shí)， 用我建立的一個(gè)液相色譜方法進(jìn)一個(gè)基體空白樣品時(shí)會(huì)遇到很高的壓力 ，甚至自動(dòng)停泵。 問題出在自動(dòng)進(jìn)樣器上，因?yàn)槿绻断逻M(jìn)樣器出口管的連接接頭， 壓力是高的； 但斷開從泵到進(jìn)樣器的給料管時(shí)，壓力則正常。 通常，壓力在幾分鐘內(nèi)就能降至正常。 流動(dòng)相是乙腈和 pH7的緩沖液 。 樣品是高鹽基體中的生物分子,樣品在其制備期間被脫鹽 。 是基體空白樣中的鹽引起這個(gè)問題嗎 ?

解答

你觀察到的壓力增大很可能是由系統(tǒng)中鹽的沉淀引起的。 應(yīng)該知道鹽的濃度和流動(dòng)相的確切組成。當(dāng)乙腈同鹽和緩沖液混合時(shí)，溶解度很差是大家熟知的，例如，實(shí)驗(yàn)室分析工作者發(fā)現(xiàn)，水相含有25mmol/L  以上磷酸鹽時(shí), 乙腈濃度約大于80%就無法操作梯度系統(tǒng)了。有時(shí)，緩沖液與乙腈在主體溶液中混合不出現(xiàn)問題 ,但在線混合卻有了溶解度問題，因?yàn)槌霈F(xiàn)在混合界面的沉淀會(huì)使管道或?yàn)V片堵塞。

為了解決這個(gè)問題，采用兩種方法之一；或者在進(jìn)樣前稀釋樣品基體 ，或者通過相同的步驟凈化樣品 。 若一定要進(jìn)等量的樣品基體， 就要把稀釋倍數(shù)和進(jìn)更大的樣品體積結(jié)合起來， 例如，稀釋基體4倍， 進(jìn)樣4次同量的基體。

還可以選擇甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑。 鹽和緩沖液在甲醇中比在乙腈中有更好的溶解度。 當(dāng)然， 甲醇也許不能為你的方法提供所需要的色譜選擇性， 因此使用這種溶劑也可能并不奏效。分析工作者應(yīng)避免使用容易使液相色譜中的樣品和緩沖液出現(xiàn)沉淀的各種條件。 電壓升高或出現(xiàn)堵塞，充其量把系統(tǒng)沖洗一下即可解決， 但若在色譜柱中出現(xiàn)了沉淀， 你就應(yīng)該更換色譜柱， 因?yàn)檫@種沉淀不大可能再被溶解除去。

小結(jié)

將所有變量保持恒定時(shí)， 用液相色譜方法對(duì)同一化合物的重復(fù)進(jìn)樣應(yīng)得出相同的結(jié)果。每次進(jìn)樣在峰面積、保留時(shí)間或其它所測(cè)參數(shù)上的偏差大于正常系統(tǒng)誤差時(shí)， 顯然是一個(gè)或多個(gè)變量控制不當(dāng)?shù)拇_切標(biāo)志。 本文系統(tǒng)地、一步一步地將問題孤立了出來并給出了合乎邏輯的校正方法。