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免疫放射分析技術(shù):核素標記的抗體檢測抗原

來源:武漢貝茵萊生物科技有限公司   2010年12月03日 11:36  

1968年Miles和Hales建立了利用核素標記的抗體檢測抗原的放射分析法,為了與放射免疫分析區(qū)別,故稱免疫放射分析技術(shù)(immunoradiometric assay,IRMA)。由于它應用核素標記抗體作為示蹤劑,在反應體系中加入過量的抗體,待測抗原(或標準品)與和核素標記抗體進行全量反應,故亦稱非競爭性免疫分析法。IRMA與RIA相比較有以下特點:

1、IRMA反應系統(tǒng)中應用的標記物為免疫球蛋白。易于提純和進行碘化標記,標記抗體的比活度較高,有利于提高分析的靈敏度,且不同抗體的標記方法基本相同;而在RIA中應用的標記物是抗原??乖N類繁多,化學結(jié)構(gòu)各異,較難獲得純品,標記方法亦多種多樣。

2、在IRMA反應系統(tǒng)中使用過量的標記抗體,直接與抗原結(jié)合,不存在競爭結(jié)合的復雜反應,因此反應速度較快,即使使用親和力較低的單可隆抗體,也能滿足實驗要求;而在RIA中抗體是微量的,所以一定要用高親和力的多可隆抗體

3、IRMA使用的標記抗體和固相抗原在反應中都是過量的,只有待測樣品加樣誤差才會影響分析結(jié)果,因此IRMA的批內(nèi)和批間變異(CV%)比較??;而RIA使用的抗體和標記抗原在反應中是固定量的,加樣誤差可嚴重影響測定結(jié)果。

一、基本原理

將核素標記在抗體上,然后以過量的標記抗體與待測抗原結(jié)合,未結(jié)合的標記抗體通過和固相的抗原免疫吸附劑結(jié)合而去除,溶液中的放射性與待測抗原的含量呈正相關(guān)。根據(jù)檢測過程的操作步驟不同,有以下幾種類型

1、直接IRMA法

將待測抗原與過量的標記抗體進行溫育,使二者結(jié)合,然后加入固相抗原免疫吸附劑再次溫育,吸附游離的標記抗體。離心去除沉淀物,測定上清液中放射性強度,根據(jù)標準曲線即可得知待測樣品中抗原的含量。

2、雙抗體夾心IRMA法

在待測抗原內(nèi)依次加入固相抗體和標記抗體,反應后形成固相抗體(Ab1)-抗原-標記抗體(Ab2)復合物,洗滌去除游離的標記抗體,測定固相抗體或載體上免疫復合物的放射性強度,根據(jù)標準曲線即可得知待測樣品中抗原的含量。此法僅用于檢測有多個決定簇的多肽和蛋白質(zhì)抗原。

3、間接IRMA法

此法是在上述雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上,進一步改良為用核素標記抗Ab2的抗體(羊抗兔或抗鼠的IgG),反應后形成固相抗體(Ab1)-抗原-Ab2-*Ab3(標記抗抗體)的四重免疫復合物。其中,Ab3可作為通用試劑,可省去標記針對不同抗原的特異性抗體。

4、BSA-IRMA法

是將生物素-親合素系統(tǒng)(BSA)引入免疫放射分析,建立的新一代IRMA。此法zui大的優(yōu)點是使用生物素化抗體和以核素標記親合素為示蹤劑,可以通用于甾體類、前列腺素等小分子物質(zhì)的檢測。由于1個抗體分子上可標記數(shù)十個生物素分子,而每個親合素又可與4個生物素分子結(jié)合,從而產(chǎn)生多級放大效應。同時生物素與親合素之間的親和力要比抗原抗體間的親和力大10萬-100萬倍,二者結(jié)合極為穩(wěn)定,因此,使其靈敏度、特異性和精密度都大大提高。目前一些超靈敏度的IRMA分析試劑盒就是應用上述原理制成的。

二、基本試劑及材料

1、標記抗體

2、固定抗原吸附劑

3、標準抗原

4、待測樣本

5、γ計數(shù)儀和低溫離心機

三、操作方法

以固相雙抗體法測定血清中促甲狀腺素(TSH)為實例

1、按下表逐一加樣(加樣量為ml,均設(shè)雙復管)

 

混勻,37℃溫育120min

棄上清(T*除外,以下同),加2ml洗滌液,放置2min

棄上清,再加2ml洗滌液,放置2min

棄上清,將各管倒置在吸水紙上

2、用γ計數(shù)儀分別測量各管放射性強度,以兩管cpm的均值表示,分別計算結(jié)合率(B%,即B/T* ´100%)

3、用B%為縱坐標,不同濃度的TSH標準品為橫坐標繪制標準曲線,然后根據(jù)檢測管的B%,從標準曲線中即可查得相應的TSH含量

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