細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是上海達(dá)為科生物的基礎(chǔ)服務(wù)項(xiàng)目之一，由細(xì)胞平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員操作完成。
 

　　一.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
 

　　1. MTT法:是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。該方法已廣泛于生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快捷。原理:活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚( Formazan )并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜( DMSO )能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值,可間接反 映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi), MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
 

　　2. CCK-8法:可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析,常用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。原理:該試劑中含有WST-8 [化學(xué)名: 2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽], 它在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪諭硫酸_二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物( Formazan dye )。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
 

　　3. Brdu:即5- Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期, S期活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物雙重染色可判斷增殖細(xì)胞的種類,增殖速度,對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測(cè)。因此BrdU檢測(cè)需采用DNA酶或HCI或加熱使DNA變性。這些處理方法會(huì)破壞抗原識(shí)別位點(diǎn),此外許多細(xì)胞周期分析的染料都需要dsDNAD這種處理方法也使得同一樣本無(wú)法同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
 

　　4. EDU:即5-Ethynyl-2' - deoxyuridine,是-種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期
 代替胸腺嘧啶(T )滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性,適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究,尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、 小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。
 

　　二、細(xì)胞凋亡
 

　　ANNEXIN V-PI法:在正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸( PS )只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸( PS )由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~ 36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之- -。將Annexin V進(jìn)行熒光素( EGFP、FITC )標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶( Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞, PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
 

　　三、細(xì)胞遷移和侵襲
 

　　1. Transwell :是一種侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù),其實(shí)原理簡(jiǎn)單地說(shuō)就是用一層膜將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開(kāi),細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里,為了找吃的,細(xì)胞會(huì)往高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑,但是有膜擋著,所以要穿過(guò)膜才行。我們?cè)谀ど贤可? -層基質(zhì)膠,模仿細(xì)胞外基質(zhì),于是細(xì)胞要把基質(zhì)消化了才可以從低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面,后我們檢測(cè)高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里細(xì)胞量就可以知道細(xì)胞的侵襲能力了。
 

　　2.劃痕實(shí)驗(yàn):是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上,用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線,去除中央部分的細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間(例如72h),取出細(xì)胞培養(yǎng)板,觀察周邊細(xì)胞是否生長(zhǎng)(修復(fù))至中央劃痕區(qū),以此判斷細(xì)胞是否生長(zhǎng)(修復(fù))至中央劃痕區(qū),以此判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力, 實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過(guò)不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。