CAT#:20002173
PRODUCT NAME:Protein Purify&Concentrate-3K kit
SIZE:5 units
產(chǎn)品品牌:Nanoimmunotech
液體類(lèi)標(biāo)本：
標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個(gè)標(biāo)本量收集體積＝100ul×檢測(cè)種類(lèi)。
◇      血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇      血漿：
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10％(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇      尿液、胸腹水、腦脊液：
用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇      細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇      組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/ml的Aprotinin。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清置于-20度或- 70度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

　　液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？

　　要冷藏??！因?yàn)橐后w培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時(shí)，其溶液的pH值會(huì)發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會(huì)受到影響對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月 ~ 一年。

　　細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活測(cè)試
1、原理：
(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
(2)血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
(3)存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。

　　細(xì)胞特性
在細(xì)胞培養(yǎng)之前，我們要了解一下你所要養(yǎng)細(xì)胞的基本特性，這點(diǎn)可以從細(xì)胞的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或者從ATCC細(xì)胞庫(kù)查詢。除此之外我們還要知道每管細(xì)胞的數(shù)量，建議分裂或傳代的比例，和已知細(xì)胞的傳代代次等信息。

　準(zhǔn)備培養(yǎng)基
復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需要準(zhǔn)備合適的培養(yǎng)基，血清和細(xì)胞生長(zhǎng)所需的添加劑。大部分培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)體系，可以在訂購(gòu)細(xì)胞系時(shí)獲得。
雖然大多數(shù)細(xì)胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是當(dāng)培養(yǎng)基改變時(shí)，細(xì)胞的性質(zhì)也會(huì)變化。因此，使用細(xì)胞庫(kù)推薦的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)獲得的效果。

　開(kāi)啟凍存管
1.準(zhǔn)備一個(gè)培養(yǎng)瓶，加入適宜細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，液體體積按照說(shuō)明書(shū)的推薦配置，并平衡培養(yǎng)基的溫度和pH（CO2）?！?br/>2.在37℃水浴中或細(xì)胞的正常生長(zhǎng)溫度下將凍存管輕輕搖動(dòng)。解凍要快，約2分鐘或直到冰晶融化即可。
3.從水浴中取出凍存管并用浸泡或噴灑70%乙醇的方式來(lái)消毒。進(jìn)一步的操作均需在無(wú)菌操作臺(tái)中嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行。
4.擰開(kāi)凍存管的管帽并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有9 ml推薦培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中。通過(guò)溫和離心（125×g 10 min）除去冷凍保護(hù)劑（DMSO）。棄去上清，并用1或2 ml*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將這些細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動(dòng)以*混勻。
5.培養(yǎng)24小時(shí)后檢查細(xì)胞狀態(tài)并在需要時(shí)進(jìn)行傳代。

　培養(yǎng)用液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

　　由于，大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。

　　但總體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些，偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，我們?cè)谂渲婆囵B(yǎng)用液時(shí)，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過(guò)0.10um或0.22um濾膜過(guò)濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。