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一個月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工 |
CAT#:51004117V/510041160/51004116C/51004116F
PRODUCT NAME:Citrate stabilized 100nm-1 OD
SIZE:25 ml/100 ml/250 ml/500 ml
產(chǎn)品品牌:Nanoimmunotech
液體類標(biāo)本：
標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包
CAT#:51004117V/510041160/51004116C/51004116F
PRODUCT NAME:Citrate stabilized 100nm-1 OD
SIZE:25 ml/100 ml/250 ml/500 ml
產(chǎn)品品牌:Nanoimmunotech
液體類標(biāo)本：
標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個標(biāo)本量收集體積＝100ul×檢測種類。
◇ 血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇ 血漿：
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10％(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇ 尿液、胸腹水、腦脊液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇ 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇ 組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/ml的Aprotinin。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清置于-20度或- 70度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？
要冷藏?。∫?yàn)橐后w培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時，其溶液的pH值會發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會受到影響對細(xì)胞生長不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年。
細(xì)胞計數(shù)及存活測試
1、原理：
(1)計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細(xì)刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細(xì)刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_盼蘭對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準(zhǔn)確。
細(xì)胞特性
在細(xì)胞培養(yǎng)之前，我們要了解一下你所要養(yǎng)細(xì)胞的基本特性，這點(diǎn)可以從細(xì)胞的產(chǎn)品說明書或者從ATCC細(xì)胞庫查詢。除此之外我們還要知道每管細(xì)胞的數(shù)量，建議分裂或傳代的比例，和已知細(xì)胞的傳代代次等信息。
準(zhǔn)備培養(yǎng)基
復(fù)蘇細(xì)胞時需要準(zhǔn)備合適的培養(yǎng)基，血清和細(xì)胞生長所需的添加劑。大部分培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)體系，可以在訂購細(xì)胞系時獲得。
雖然大多數(shù)細(xì)胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，但是當(dāng)培養(yǎng)基改變時，細(xì)胞的性質(zhì)也會變化。因此，使用細(xì)胞庫推薦的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞會獲得的效果。
開啟凍存管
1.準(zhǔn)備一個培養(yǎng)瓶，加入適宜細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，液體體積按照說明書的推薦配置，并平衡培養(yǎng)基的溫度和pH（CO2）?！?br/>2.在37℃水浴中或細(xì)胞的正常生長溫度下將凍存管輕輕搖動。解凍要快，約2分鐘或直到冰晶融化即可。
3.從水浴中取出凍存管并用浸泡或噴灑70%乙醇的方式來消毒。進(jìn)一步的操作均需在無菌操作臺中嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。
4.擰開凍存管的管帽并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個含有9 ml推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125×g 10 min）除去冷凍保護(hù)劑（DMSO）。棄去上清，并用1或2 ml*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將這些細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動以*混勻。
5.培養(yǎng)24小時后檢查細(xì)胞狀態(tài)并在需要時進(jìn)行傳代。
由于，大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。
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