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三維多細(xì)胞類球體（腫瘤球、微球、類器官）可以幫助我們?cè)谂R床前藥物篩選階段更好地預(yù)測(cè)多種候選藥物的潛在作用。但是，相較于二維單層培養(yǎng)細(xì)胞，采用三維培養(yǎng)細(xì)胞模型系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析則更具挑戰(zhàn)性。

一起來(lái)看看珀金埃爾默是如何分析3D微組織球三維體積與分區(qū)的吧！

3D微組織球的制備和成像過(guò)程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制備細(xì)胞球

在CellCarrier Spheroid表面極低吸附力96孔微孔板（珀金埃爾默公司，貨號(hào)6055330）中接種 HeLa 細(xì)胞，細(xì)胞濃度分別為1.25E3、2.5E3與5E3。48小時(shí)后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™染料對(duì)胞核染色。如前文所述，用磷酸化組蛋白H3抗體（西格瑪奧德里奇公司，貨號(hào)H9908）和Alexa 546二抗體（美國(guó)生命技術(shù)公司，貨號(hào)A11081）聯(lián)合標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞。為達(dá)到快速成像的需求，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用長(zhǎng)工作距離物鏡，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。對(duì)于高分辨率深度成像試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞球轉(zhuǎn)入兼容高質(zhì)量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃爾默公司，貨號(hào)6057300），然后利用ScaleA2試劑進(jìn)行透明化處理。

“預(yù)掃描（PreciScan）”功能大大縮短圖像采集時(shí)間并減小數(shù)據(jù)量

研究人員利用Harmony軟件的“預(yù)掃描（PreciScan）”功能掃描拍攝所有細(xì)胞球的圖像。“預(yù)掃描（PreciScan）”是一項(xiàng)智能圖像采集功能，它可以智能識(shí)別確定各孔內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞的x/y坐標(biāo)位置。通過(guò)低倍預(yù)掃描、智能聯(lián)機(jī)分析和高倍再掃描，生成目標(biāo)細(xì)胞的高分辨率圖像。再掃描可以包含z-stack多層掃描和 / 或時(shí)間序列掃描。“預(yù)掃描（PreciScan）”功能有效節(jié)省了測(cè)量和分析時(shí)間并減小了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存空間（例如，使用20x物鏡對(duì)在384孔微孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞球進(jìn)行觀察分析時(shí)，預(yù)掃描可幫助減少25倍的分析時(shí)間和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存空間；而使用40x物鏡觀察時(shí)，可減少100倍的分析時(shí)間和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存空間），Operetta CLS與Opera Phenix系統(tǒng)都配置有這一功能。

利用水浸物鏡與光透明化技術(shù)優(yōu)化成像深度

使用水浸物鏡，大大提高了成像質(zhì)量，特別是提升了Z軸分辨率。此外，光透明化處理進(jìn)一步改善了成像深度。光透明化處理不僅提高了樣品內(nèi)指標(biāo)的均一性，而且減少了光散射和光學(xué)像差。在此基礎(chǔ)上，采用長(zhǎng)波長(zhǎng)染色（如可行）也有利于減少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D樣品上。因此，可顯著提升成像深度和信號(hào)檢測(cè)效率。

3D微組織球重構(gòu)與分析

生成三維或 XYZ 軸圖像

生成三維樣品的 XYZ 軸或三維圖像；

在三維空間中變換樣品圖像——旋轉(zhuǎn)、縮放或平移；

導(dǎo)出視頻——三維重建或涵蓋多層平面視圖的視頻。

定位細(xì)胞球與胞核

使用“定位圖像區(qū)域（Find Image Region）”功能定位整個(gè)細(xì)胞球；

采用局部光強(qiáng)閾值進(jìn)行 Z 軸光衰減補(bǔ)償；

選用一種“定位胞核（Find Nuclei）”方法——專門用于 3D 圖像胞核分割。

計(jì)算細(xì)胞球與胞核三維指標(biāo)

使用“計(jì)算形態(tài)特性參數(shù)（Calculate Morphology Properties）”工具分析細(xì)胞球和球體內(nèi)單細(xì)胞的三維形態(tài)特征。

定位有絲分裂細(xì)胞

使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根據(jù)局部光強(qiáng)閾值定位有絲分裂、 pHH3 陽(yáng)性細(xì)胞；

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”功能生成剖視圖，從內(nèi)部（右側(cè)）觀察細(xì)胞球。

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”工具生成剖視圖

進(jìn)行細(xì)胞分區(qū)，分析有絲分裂細(xì)胞分布情況

計(jì)算出每個(gè)胞核到細(xì)胞球邊界的短距離；

使用“選擇區(qū)域”和“選擇細(xì)胞群”功能，將胞核分成不同區(qū)域?？呻S意調(diào)整區(qū)域?qū)挾龋?/span>

分析每個(gè)區(qū)域有絲分裂細(xì)胞數(shù)量和空間分布差異，得到各種不同的分析數(shù)據(jù)（例如，細(xì)胞形態(tài)參數(shù)）。

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”工具生成剖視圖

基于Harmony4.8軟件的整體成像細(xì)胞球三維分析方法我們可以檢測(cè)到細(xì)胞球整體的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞球同心區(qū)單細(xì)胞特性。采用DRAQ5™染料（紅色）和pHH3抗體（橙色）標(biāo)記細(xì)胞球，然后用ScaleA2試劑進(jìn)行光透明化處理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系統(tǒng)裝配的20x水浸物鏡（數(shù)值孔徑1.0）和間距為1µm的 z-stack模塊（z軸掃描高度：300µm）記錄共聚焦三維圖像。Opera Phenix系統(tǒng)的3D成像質(zhì)量更佳。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Operetta CLS系統(tǒng)在被測(cè)HeLa細(xì)胞球的成像深度和胞核檢測(cè)性能方面與之不相上下。此處第4和第5步驟操作僅以O(shè)pera Phenix系統(tǒng)成像展示，Operetta CLS系統(tǒng)成像效果與之相當(dāng)。

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