毒性蛋白質(zhì)病(Proteinopathy)通常由細胞內(nèi)或細胞外沉積大量折疊變異的蛋白質(zhì)(Misfolded protein)所致。在蛋白合成和成熟過程中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，如蛋白突變、折疊以及翻譯后修飾出現(xiàn)異常都有可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)病的發(fā)生。雖然蛋白質(zhì)病這個術(shù)語對很多人來說還比較陌生，但現(xiàn)已證明其和多種嚴重的神經(jīng)性疾病，如阿爾茲海默癥、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)的發(fā)生密切相關(guān)。靶向蛋白質(zhì)病的研究也為屢屢受挫的神經(jīng)退行性疾病治療提供了新的曙光[1,2]。
高內(nèi)涵整體解決方案的優(yōu)異體現(xiàn)
在七月的Cell主刊中，研究將目光轉(zhuǎn)至由MUC1基因移碼突變導(dǎo)致的腎病(MUC1 kidney disease ,MKD)[3]。與神經(jīng)性退行性疾病類似，MKD目前尚無有效治療手段。結(jié)合細胞系、小鼠模型、病人組織和日益火熱的類器官來源樣本，研究證實MUC1突變蛋白(MUC1-fs)會大量聚集在細胞內(nèi)，并終激活未折疊蛋白應(yīng)答(Unfolded protein response UPR)，誘發(fā)細胞損傷和毒性。因此，MKD也屬于蛋白質(zhì)病的一種。針對該發(fā)病機制，研究實施基于高內(nèi)涵平臺的高通量篩選，并成功獲得能特異清除突變MUC1蛋白的小分子藥物BRD4780。該研究不僅深入我們對蛋白轉(zhuǎn)運異常發(fā)生機制的了解，也為多種毒性蛋白質(zhì)病提供了新的治療策略和切入點。在七月的研究熱點版塊中，Nature Review Drug Discovery專門針對發(fā)現(xiàn)進行了解析[4]。
該研究也體現(xiàn)了珀金埃爾默高內(nèi)涵整體解決方案的應(yīng)用。成像平臺Opera Phenix配合CellCarrier Ultra系列微孔板主導(dǎo)高內(nèi)涵篩選的同時，并通過水鏡優(yōu)勢參與了基于上述四種樣本的所有熒光拍攝和動態(tài)追蹤分析細胞凋亡進程。針對類器官樣本的拍攝，PreciScan功能被用于提速拍攝進程和排除不需要的圖像采集和分析。所有的熒光分析由Harmony軟件完成，尤其是‘spot’分析功能的應(yīng)用。
a疾病解析
通過MKD病人和體外模型等樣本，研究使用抗體染色方式分析野生型MUC1和對應(yīng)突變產(chǎn)物的組織和細胞分布。在不同來源的樣本中，值得一提的是基于病人誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells , iPS cells)建立的類器官(Organoid)樣本。基于干細胞技術(shù)的類器官模型建立和分析也是近年來高內(nèi)涵的優(yōu)勢應(yīng)用方向之一[5]。與病人的切片結(jié)果一致，野生型MUC1主要分布在類器官的頂膜部位，而突變蛋白則分布在細胞內(nèi)。進一步研究證明聚集在細胞內(nèi)的突變MUC1會誘發(fā)細胞應(yīng)激，活化ATF6-UPR通路并終導(dǎo)致細胞損傷，表明MKD是蛋白質(zhì)病。
基于MKD病人的腎類器官模型染色，圖片由Opera Phenix拍攝。
紅色指示野生型MUC1蛋白；綠色指示突變體MUC1蛋白；藍色為E-cadherin；黃色為Na/K ATPase標記基底外側(cè)膜。
b高內(nèi)涵篩選
為了發(fā)現(xiàn)能有效清除突變蛋白的藥物，研究針對病人樣本建立永生化細胞系，并利用Opera Phenix開展大規(guī)模、多指標高內(nèi)涵篩選。在初篩中，研究關(guān)注能清除突變蛋白并無顯著細胞毒性的藥物，并在此基礎(chǔ)上細化篩選藥物濃度開展二輪篩選。通過兩輪篩選后，研究通過特異性、mRNA水平調(diào)控和是否能抑制ER應(yīng)激藥物thapsigargin的細胞毒性三個指標來進一步分析候選藥物。
高內(nèi)涵篩選流程圖
終，從3713種化合物中，研究成功發(fā)現(xiàn)BRD4780滿足上述的指標，能有效特異清除突變蛋白的同時不影響MUC1轉(zhuǎn)錄水平，并能保護病人模型細胞系不受thapsigargin的應(yīng)激壓力。進一步的實驗證明BRD4780能工作于類器官模型和小鼠模型，是非常有潛力的MKD治療藥物。
左圖：基于細胞系的染色結(jié)果，黃色指示野生型MUC1蛋白；綠色指示突變體MUC1蛋白；灰色指示細胞核。
右圖：對應(yīng)的統(tǒng)計分析和細胞數(shù)變化分析。
c機制研究
為了解析MUC1突變體亞細胞聚集原理和BRD4780工作機制，研究利用成像技術(shù)進行大量共定位研究，并發(fā)現(xiàn)病人來源細胞系中MUC1突變體滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的早期分泌通路中，并與運貨受體TMED9有顯著的共定位趨勢，且這個現(xiàn)象能進一步在多種模型和病人組織中重現(xiàn)。通過動態(tài)成像追蹤，研究證明BRD4780能將滯留的突變蛋白從早期分泌途徑中釋放出來，并促進其進入溶酶體降解途徑。
基于細胞系的亞細胞共定位研究，分析基于Harmony軟件的‘spot’ 分析功能。
基于細胞系、小鼠模型、病人組織和類器官來源樣本的熒光染色分析，紅色指示TMED9；綠色指示突變體MUC1蛋白；灰色指示細胞核。
* 熒光圖片均由Opera phenix 拍攝。
非常有意思的是，在病人樣本中研究同時也發(fā)現(xiàn)TMED9蛋白水平的上升，而BRD4780處理同樣能降低TMED9蛋白水平。此外，通過CRISPR技術(shù)敲除TMED9能表型模擬BRD4780的處理效果，清除突變蛋白。因此，TMED9參與了MUC1突變體在早期分泌途徑的滯留和積累，并可能是BRD4780的直接作用靶點。針對此，研究采取細胞熱移位測定法(Cellular thermal shift assay，CETSA)證實細胞內(nèi)BRD4708和TMED9存在直接相互作用。憑借其能在生理條件下進行細胞水平分析的優(yōu)勢，CETSA成為了內(nèi)源蛋白-藥物相互作用分析技術(shù)的生力軍，是表性篩選下游藥物解析的利器。
基于CETSA方法在細胞水平確認BRD4708能直接結(jié)合TMED9
綜合上述的發(fā)現(xiàn)，研究向我們闡釋了MKD的發(fā)病以及BRD4780的作用機制。通過直接結(jié)合TMED9，BRD4780將突變的MUC1蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的早期分泌通路中釋放出來，加速溶酶體對其的清除。令人興奮的是，在具有很好的藥理性質(zhì)的同時，BRD4780不僅能作用于MKD，還能作用于其他多種膜相關(guān)蛋白導(dǎo)致的毒性蛋白質(zhì)病，如UMOD突變相關(guān)的慢性腎病和色素性視網(wǎng)膜炎等，是非常有潛力的候選藥物。
MKD的發(fā)病機制和BRD4780的作用機制圖
同時，該研究也是高內(nèi)涵兩大應(yīng)用領(lǐng)域的精華案例。首先是亞細胞水平成像應(yīng)用，研究中涉及到的大量定位、共定位研究和動態(tài)追蹤蛋白轉(zhuǎn)運過程都是高內(nèi)涵的優(yōu)勢應(yīng)用場景。其次，更為關(guān)鍵的是，該研究也是成像篩選主導(dǎo)的藥物發(fā)現(xiàn)案例。從疾病模型表型的建立到靶向逆轉(zhuǎn)疾病相關(guān)表型的篩選，和后下游的藥物機制研究，都離不開珀金埃爾默高內(nèi)涵解決方案。高內(nèi)涵解決方案，伴隨著機器學(xué)習(xí)的逐漸成熟，將成為創(chuàng)新藥物研發(fā)行業(yè)的新鮮血液[6]。
參考文獻
1. Ganguly G, et al.Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Drug Des Devel Ther. 2017 Mar 16;11:797-810.
2. Scotter EL, et al.TDP-43 Proteinopathy and ALS: Insights into Disease Mechanisms and Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 2015 Apr;12(2):352-63. doi: 10.1007/s13311-015-0338-x.
3. Dvela-Levitt M, et al.Small Molecule Targets TMED9 and Promotes Lysosomal Degradation to Reverse Proteinopathy. Cell. 2019 Jul 25;178(3):521-535.e23.
4. A novel approach to reverse proteinopathies https://www.nature.com/articles/d41573-019-00133-5
5. Czerniecki SM, et al.High-Throughput ScreeningEnhancesKidneyOrganoid Differentiation from HumanPluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell. 2018 Jun 1;22(6):929-940.e4.
6. Machine learning brings cell imaging promises into focus https://www.nature.com/articles/d41573-019-00144-2
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