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作者單位：1（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036）2(安徽省獸醫(yī)工作站，合肥 230022）3（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，合肥 230036）

【摘要】  本研究建立了基于基質(zhì)固相分散萃?。?/span>MSPD）液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLC/UVD）的同步檢測(cè)雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留的快速、和經(jīng)濟(jì)的新方法。正交試驗(yàn)優(yōu)化后的基質(zhì)固相分散萃取的*條件如下，預(yù)混有地克珠利和妥曲珠利混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的0.5 g雞組織勻漿在研缽中與2 g Cl8填料研勻，靜置2～5 min后裝萃取柱；萃取柱自底層到上層依次裝入玻璃棉、1.5 g 無(wú)水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無(wú)水Na2SO4; 壓緊后依次用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗， 8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，0.5 mL 流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)。*色譜條件為C18分析柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm，AUFS =0.05；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：20℃。該檢測(cè)方法的定量線性范圍為50～1000 μg/L。在50、500和1000 ng/g的添加水平，地克珠利和妥曲珠利從雞組織中的回收率范圍為71.1%～84.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍為3.8%～12.1%；同時(shí)方法的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.70％～ 6.77%。地克珠利的檢出限為8 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、腎），妥曲珠利的檢出限為 7 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、腎）; 地克珠利的定量限為12 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、腎），妥曲珠利的定量限為 10 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、腎）。

【關(guān)鍵詞】  基質(zhì)固相分散萃取，液相色譜紫外檢測(cè)法，地克珠利，妥曲珠利，雞組織

基金項(xiàng)目：“十一五國(guó)家科技支撐計(jì)劃”分課題（2006BAK02A08４）、安徽省“十五”科技重大攻關(guān)項(xiàng)目（0400303041）、安徽省青年基金(04041042)

1 、 引  言

    地克珠利(diclazuril, DIC)和妥曲珠利(toltrazuril, TOL)屬均三嗪類抗球蟲(chóng)藥，被廣泛用于畜禽球蟲(chóng)病防治[1]。食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)(1996，1998)和歐盟藥品管理局（EMEA）(1996，2004）在對(duì)地克珠利和妥曲珠利的毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)評(píng)估后，制定了日允許攝入量和zui高殘留* [2～5]。

    均三嗪類抗球蟲(chóng)藥在畜禽生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，迫切需要建立一種靈敏的均三嗪類藥物殘留分析方法。歐盟藥品管理局在其評(píng)估報(bào)告中推薦使用氣相色譜電子捕獲檢測(cè)(GCμECD)檢測(cè)羊、豬和牛的可食性組織中地克珠利的殘留 [2，3]。祁彥等[６]以HPLC法測(cè)定了大豆中13種三嗪類農(nóng)藥殘留。由于地克珠利和妥曲珠利在紫外吸收光譜上的差異，目前尚未見(jiàn)同時(shí)分析動(dòng)物組織中地克珠利與妥曲珠利藥物殘留的報(bào)道。

    基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)由Barker等[7]提出并給予理論解釋的一種樣品處理技術(shù)。MSPD將常規(guī)的固相分散技術(shù)與反相鍵合填料相結(jié)合，組織勻漿、提取和凈化在同一操作中完成，分析環(huán)節(jié)大為減少、操作簡(jiǎn)化。本研究以MSPD為基礎(chǔ)，建立了地克珠利和妥曲珠利的多殘留快速分析技術(shù)，并對(duì)MSPD樣品處理過(guò)程和液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2、實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1  儀器與試劑

    HP1100液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配低壓四元泵、脫氣泵、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；Symmtry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm，美國(guó) Waters公司）； 12孔固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；AM- 6組織勻漿機(jī) ( 株式會(huì)社日本精機(jī)制作所，北京慧宇誠(chéng)越科技發(fā)展有限公司)；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化有限公司)；D37520冷凍離心機(jī)（德國(guó)Osterode am Harz 公司）。C18填料（粒徑40 μm，美國(guó)Alltech公司）；地克珠利(99.7%)、妥曲珠利(99.8%)（美國(guó)Sigma公司)；乙腈、甲醇和四氫呋喃(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；其它試劑均為分析純；Millipore 18.2 MΩ cm高純水。

2.2  實(shí)驗(yàn)方法

　　2.2.1  填料和標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 

　　C18填料預(yù)處理： 22 g C18填料，裝入50 mL玻璃注射器，依次用2倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇洗滌，真空干燥，貯于磨口玻璃干燥器內(nèi)備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液配置：準(zhǔn)確稱取地克珠利和妥曲珠利標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，置100 mL容量瓶中，用25 mL四氫呋喃溶解后，用60%乙腈水溶液定容，搖勻，2～8℃避光存放；使用時(shí)用60%乙腈水溶液稀釋至所需濃度。

　　2.2.2  色譜條件 

　　分析柱：C18(250 mm×4.6 mm i.d. 5 μm, 美國(guó) Waters公司)；流動(dòng)相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH3.0)乙腈(40+60)，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm，AUFS =0.05；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：20℃。

　　2.2.3  樣品采集 

　　健康AA肉雞，飼喂全價(jià)不含抗球蟲(chóng)藥物日糧。10 d后，采集肝臟、腎臟、肌肉樣品，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

　　2.2.4  洗脫溶劑的選擇 

　　2.0 g C18填料和一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在研缽中用研杵沿同一方向輕輕研勻?；旌衔锓胖迷谕L(fēng)柜內(nèi)0.5 h后， 轉(zhuǎn)入層析柱中，并用注射器活塞輕輕壓實(shí)。用15 mL正己烷分3次淋洗，分別收集淋洗液，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行液相色譜分析。分別用甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、超純水作為洗脫劑重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次。

　　2.2.5  基體固相分散提取條件的選擇 

　　預(yù)混有1 mL地克珠利和妥曲珠利混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的0.5 g雞組織勻漿與2 g C18填料在研缽中研勻。上述樣品混合物在通風(fēng)柜中放置 2～5 min后轉(zhuǎn)入層析柱。層析柱自下而上依次裝入玻璃棉、1.5 g無(wú)水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無(wú)水Na2SO4，壓緊。分別用16 mL 淋洗液淋洗，8 mL 洗脫液洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用0.5 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm濾膜后作為試樣溶液，然后取20 μL注入HPLC進(jìn)行檢測(cè)。 每處理重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。為考察C18填料與樣品比例、淋洗劑種類與組合、洗脫劑種類與用量對(duì)添加回收結(jié)果的影響，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按L9（34）設(shè)計(jì)表（見(jiàn)表1）進(jìn)行。表1  因素水平表（略）

3 、結(jié)果與分析

　　3.1  檢測(cè)波長(zhǎng)與色譜分離條件的確定

    文獻(xiàn)記載地克珠利均采用280 nm，而妥曲珠利采用240 nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)[8～10]。為獲得較理想的分析條件，采用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)地克珠利和妥曲珠利進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示地克珠利除280 nm處有一吸收峰外，在200～250 nm也有紫外吸收，且其在240 nm處的紫外吸收與妥曲珠利的吸收值相近，故本實(shí)驗(yàn)選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

    實(shí)驗(yàn)比較了乙酸銨∶乙腈、乙酸三乙胺∶乙腈、磷酸鹽緩沖液∶乙腈和H3PO4三乙胺∶乙腈４種流動(dòng)相體系對(duì)地克珠利和妥曲珠利的分離效果。結(jié)果表明，在H3PO4三乙胺∶乙腈體系中地克珠利和妥曲珠利在較短的時(shí)間內(nèi)分離效果，且柱壓較低。在本實(shí)驗(yàn)選擇的0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)為流動(dòng)相的條件下，地克珠利和妥曲珠利在12 min內(nèi)獲得基線分離。

　　3.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

    用60%乙腈水溶液將混合儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為 50、100、200、500、1000 ng/mL的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行液相色譜分析。每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定4次，取平均值繪制色譜峰面積濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得地克珠利和妥曲珠利藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線。地克珠利：CDIC=21.11SDIC–32.76， r＝0.9998；妥曲珠利：CTOL=23.56STOL–21.65，r＝0.9995。C為藥物濃度（ng/mL），S為色譜峰面積（mAu s）。

　　3.3 MSPD條件的優(yōu)化

　　3.3.1  洗脫溶劑的選擇 

　　研究了正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯和水對(duì)地克珠利和妥曲珠利的洗脫能力（見(jiàn)表2）。由表2數(shù)據(jù)可知：正己烷和水對(duì)地克珠利和妥曲珠利無(wú)洗脫能力，只能洗掉C18柱上結(jié)合力很小的一些雜質(zhì)，適于作淋洗液；二氯甲烷與乙酸乙酯可洗脫部分地克珠利和妥曲珠利，但洗脫能力較弱不適于作為洗脫劑；甲醇和乙腈的洗脫能力強(qiáng)，在較少體積即可達(dá)到滿意的回收率。表2  不同溶劑的洗脫回收率（略）

　　3.3.2  正交試驗(yàn)結(jié)果 

　　為減少動(dòng)物組織中復(fù)雜基質(zhì)成分對(duì)紫外檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用兩步洗脫法，先用淋洗液對(duì)樣品進(jìn)行清洗凈化，再使用洗脫劑進(jìn)行洗脫。按L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行了不同的淋洗液的凈化效果和洗脫劑的洗脫能力研究。研究結(jié)果列于表3和表4。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，填料用量、洗脫劑種類和用量3種因素對(duì)回收率影響較大，達(dá)到*回收的因素水平分別為： 2、3、3、3（地克珠利）和2、2、3、3（妥曲珠利）。盡管適用二者的淋洗液組成有一定差異，但考慮到使用8 mL 正己烷+8 mL 甲醇水溶液（1∶4, V/V）較8 mL正己烷+8 mL水淋洗生成的色譜圖要干凈一些，且淋洗液組成在各因素中對(duì)回收率的影響zui小，所以本實(shí)驗(yàn)采用了2、3、3、3的組合作為優(yōu)化后的樣品前處理方法。混有一定量混合標(biāo)準(zhǔn)液的0.5 g雞組織樣品加到研缽中的 2 g Cl8填料上，研勻，在通風(fēng)柜中放置2～5 min后，將混合樣品轉(zhuǎn)入層析柱中。層析柱自下而上依次裝入玻璃棉、1.5 g無(wú)水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無(wú)水Na2SO4，壓緊。分別用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗，然后用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用0.5 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm濾膜后作為試樣溶液，然后取20 μL 注入HPLC進(jìn)行檢測(cè)。表3  正交試驗(yàn)結(jié)果（略）表4  地克珠利與妥曲珠利回收率的極差（略）

　　3.4  標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率

    稱2 g C18填料置玻璃研缽中，將0.5 g 剁碎的雞組織樣品加到研缽中的C１8填料上，添加1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（25、250和500 μg/L），使組織中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別相當(dāng)于50、500和1000 ng/g，研勻，按優(yōu)化后的方法處理。取處理后的樣品液，用HPLC法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算公式為：X=A樣C對(duì)V/A對(duì)M式中: X為試料中DIC、TOL的殘留量(ng/g)；A樣為試樣溶液中相應(yīng)珠利的峰面積；A對(duì) 為對(duì)照溶液中相應(yīng)珠利的峰面積；C對(duì) 為對(duì)照溶液中相應(yīng)珠利的濃度(μg/L)；V為試樣溶液體積(mL)；M為供試試料的質(zhì)量(g)。以測(cè)定結(jié)果與實(shí)際添加藥物濃度的比值計(jì)算樣品添加回收率。由表5中結(jié)果可以看出地克珠利和妥曲珠利在3種組織樣品中的回收率均大于70%，符合殘留檢測(cè)要求。表5  地克珠利、妥曲珠利在雞組織中提取回收率(略)

　　3.5  精密度(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)

    取含有地克珠利和妥曲珠利高、中、低(50、100和1000 ng/g) 3種濃度的肌肉組織樣品各3份，按優(yōu)化后的方法處理后測(cè)定。分別于同日內(nèi)5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)及3個(gè)不同日內(nèi)重復(fù)制樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)變異和日間變異。由表6可知地克珠利和妥曲珠利的日內(nèi)、日間變異系數(shù)均低于15%，符合殘留分析對(duì)精密度的要求。表6  地克珠利和妥曲珠利的測(cè)定精密度（略）

　　3.6  檢出限與定量下限

    取空白的肌肉、肝臟、腎臟樣品，10個(gè)平行，按上述樣品前處理的方法處理，測(cè)得基線噪音值B0，以B0+3SD為檢出限(LOD), B0+10 SD為定量限(LOQ )。地克珠利的檢出限分別為8 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、腎）；定量限分別為12 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、腎）。妥曲珠利的檢出限分別為7 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、腎）；定量下限分別為10 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、腎）。結(jié)果表明，本方法在準(zhǔn)確度、精密度上均達(dá)到了殘留分析的要求。