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《第六屆全國(guó)抗菌藥物臨床藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集》2006

臨床分離耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型研究

【摘要】：目的金葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥是由mecA基因介導(dǎo)的,這種基因是由一種*的可移動(dòng)的基因元件所攜帶,稱為葡萄球菌染色體盒Staphylococcal chromosomal cassette(SCCmec),整合在MRSA菌株的染色體上。目前國(guó)外采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)SCCmee基因分類已經(jīng)分成Ⅰ-Ⅴ 5種不同的類型,在各個(gè)分型中又分別有具體的亞型,各型發(fā)生的頻率不同。SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ主要存在于院內(nèi)感染MRSA,攜帶有多重耐藥基因, SCCmec Ⅳ型和Ⅴ型的大小要比SCCmec Ⅰ-Ⅲ小得多,主要在社區(qū)感染的MRSA。本研究目的是通過對(duì)我國(guó)多所醫(yī)院分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究,建立MRSA SCCmec分類方法;了解國(guó)內(nèi)MRSA菌株流行類別,確定我國(guó)臨床分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)葡萄球菌染色體盒(SCCmec)基因型,為臨床防治疾病的流行與控制感染提供依據(jù)。方法金黃色葡萄球菌來源于2005年1月至2005年12月全國(guó)17家醫(yī)院分離菌株,共計(jì)266株,其中160株為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌。送檢病房主要包括呼吸、血液、感染、普通外科、神經(jīng)外科、ICU等病房,標(biāo)本部位包括痰、血、引流液、關(guān)節(jié)液、膿液、尿液、傷口分泌物等。標(biāo)準(zhǔn)SCCmec分型的陽性對(duì)照菌株來源美國(guó)Rockefeller University,Hdeminia de Lencastre 教授贈(zèng)送的6株標(biāo)準(zhǔn)菌株:COL(SCCmec Type Ⅰ)、HPV107(SCCmec Type ⅠA)、BK2464(SCCmec Type Ⅱ)、 ANS46(SCCmec Type Ⅲ)、HU25(SCCmec Type ⅢA)、BM18(SCCmec Type Ⅳ),質(zhì)控菌株ATCC29213?？咕幬飿?biāo)準(zhǔn)品包括:苯唑西林、甲氧西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、紅霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、克林霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星、利福平、SMZco、萬古霉素、替考拉寧。MIC測(cè)定:采用標(biāo)準(zhǔn)平皿二倍稀釋法。將金黃色葡萄球菌接種在MH肉湯培養(yǎng)基,35℃孵育16-20h。被試菌懸液用細(xì)菌多點(diǎn)接種儀（SAKUMA）接種,每點(diǎn)接種量為 104CFU?？咕幬餃y(cè)定濃度范圍256-0．016 mg／L。根據(jù)2002年Oliveira DC實(shí)驗(yàn)方法合成9對(duì)隨機(jī)引物,擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度與目的基因?yàn)?95bp(pls), 284bp(kdp),209bp(mecI),342bp(dcs),243bp(pI258,Tn554), 3414bp(Tn554,orfX),81bp(IS431,pUB110),303bp(IS431,pT181),160bp(mecA);PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:40μL 反應(yīng)體系內(nèi)含20μL 2×Taq PCR MasterMix,MgCL2,模板DNA,根據(jù)文獻(xiàn)加入不同量的引物(濃度 400-1000nM),補(bǔ)水至總反應(yīng)體積40μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min;然后94℃變性30s,53℃退火30s, 72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);再72℃后延伸4min;瓊脂糖濃度2％,每孔加樣量為2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,0．5×Tris- 硼酸-EDTA緩沖液電泳(電壓80V),0．5ug/ml溴化乙啶染色,在紫外線下觀察產(chǎn)物片段。結(jié)果 266株金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥。苯唑西林的MIC值范圍是0．125-256mg／L,耐藥率63．9％, 甲氧西林的MIC值范圍是0．25-256mg／L,耐藥率62．0％,頭孢西丁的MIC值范圍是2-256 mg/L,耐藥率 62．8％,其它抗生素耐藥率在42．5％-84．2％,但米諾環(huán)素耐藥率為7．5％, SMZ/TMP的耐藥率為21．1％。所有菌株對(duì)萬古霉素和替考拉寧敏感,未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素中間耐藥的菌株。266株金黃色葡萄球菌中,MRSA 菌株為160株,占臨床分離菌株的60．2％。MRSA菌株對(duì)抗菌藥物耐藥性明顯高于其他藥物,對(duì)米諾環(huán)素耐藥率為14．4％,SMZ／TMP耐藥率為32．5％。160株MRSA PCR方法分型SCCmecⅡ型1株(0．6％),SCCmecⅡ型的亞型4株(2．5％),SCCmecⅢ型20株(12．5％):主要類型為SCCmec Ⅲ型的含有342bp(dcs)擴(kuò)增條帶的菌株,占MRSA菌株67．5％,該類型與SCCmecⅢ型比較不含有303bp擴(kuò)增條帶,比SCCmec ⅢA型又增加了342bp(dcs)擴(kuò)增條帶,從目前結(jié)果分析可能屬于SCCmec Ⅲ型的新型變異株,也可能是SCCmec ⅢA型的新型變異株,有待進(jìn)一步研究;SCCmec ⅢA型11株(6．9％),16株細(xì)菌未能分型(10％),未發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅳ型。主要分離到的SCCmecⅢ型主要包括的三個(gè)類型:含有dcs基因SCCmecⅢ型,*與文獻(xiàn)相符SCCmecⅢ型,以及SCCmecⅢA型,共計(jì)139株細(xì)菌對(duì)23種抗菌藥物耐藥情況為:對(duì)青霉素類以及頭孢菌素類、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素均耐藥,對(duì)亞胺培南耐藥率相似。氨基糖苷類SCCmecⅢA型對(duì)阿米卡星的耐藥率為 54．5％,明顯低于另兩型,SCCmecⅢ-dcs型的對(duì)妥布霉素的耐藥率也低于SCCmecⅢ型與SCCmecⅢA,米諾環(huán)素的耐藥率均較低,三型分別為10．2％、10％、27．3％;喹諾酮類環(huán)丙沙星、左氧沙星三型耐藥結(jié)果相似, 加替沙星、莫西沙星對(duì)SCCmecⅢ-dcs型的耐藥率明顯高于另外兩型。利福平主要耐藥類型為SCCmecⅢ-dcs 型,SMZ／TMP主要耐藥類型為SCCmecⅢ型。結(jié)論我國(guó)臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以SCCmecⅢ型為主,該類型為多重耐藥菌株,基因組成與SCCmecⅢ型及ⅢA型有差異。

【作者單位】：北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 北京大學(xué)臨床藥理研究所 
【分類號(hào)】：R450