微量凱氏定氮法

 (Mirco Kjeldahl determine)

一、目的

   1、學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理

   2、掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨含量的測(cè)定，未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計(jì)算等。

二、原理

   凱氏定氮法常用于測(cè)定天然有機(jī)物(如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等)的含氮量。

   天然的含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t變成氨，并進(jìn)-步與硫酸作用生成硫酸銨。此時(shí)程稱之為“消化”。

    但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。甘氨酸的消化過(guò)程可表示如下:

    濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氮，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量，一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止,后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)(相當(dāng)于待測(cè)物中氨的當(dāng)量數(shù))計(jì)算出待測(cè)物中的氮量。

    滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2~5.6,NH4H2BO3的藍(lán)色滴至原來(lái)H3BO3的藍(lán)紫色即為終點(diǎn)。

    本法適用范圍0.2-1.0毫克氮。相對(duì)誤差應(yīng)小于2%。

三、材料、試劑與器具

(一)材料

人的血清或豬的血清

(二)試劑

1、 濃硫酸(化學(xué)純)

2、30%氫氧化鈉(分析純)溶液

3、0.9%NaC1 溶液

4、硫酸鉀一硫酸銅混合物:硫酸鉀與硫酸銅(CuSO4、 5H2O)以3: 1 (W/W)的配比混合研磨成粉末。

5、2%硼酸

6、混合指示劑的配制:

    方法一:取50毫升0.1%甲烯藍(lán)無(wú)水醇溶液與200毫升0.1%甲基紅無(wú)水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍窄且靈敏。

    方法二: 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10毫升與0.1%甲基紅乙醇溶液2毫升混和即成。

    本指示劑的變色范圍為pH5.2→5.4→>5.6

                         紫紅色 灰色 綠色

 7.0.0100M HC1

 8.硼酸一指示劑混合液:取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。(約加1毫升左右混合指示劑)

 9.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(0.3 毫克氮/毫升)

(三)器具

1、凱氏燒瓶

2、消化架

3、吸量管(1毫升、2毫升)

4、量筒(10毫升)

5、凱氏定氮蒸餾裝置

6、微量滴定管(3毫升、5毫升，可讀至0.02毫升)

7、錐形瓶(50-100毫升)

8、容量瓶(50 毫升)

四、操作步驟

(一)樣品的處理

    血清樣品:取人血(或豬血)，放于離心管中，于冰箱中放置過(guò)液，次8離心除去凝xue塊，上層黃色透明清液即為血清。準(zhǔn)確吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升,仔細(xì)混勻備用。

   固體樣品:某一固體樣品中的含氮量是100克該物質(zhì)(千重中所含氮的克數(shù))來(lái)表示(%)。因此在定氮前，應(yīng)將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用105°C，因?yàn)榉怯坞x的水都不能在100°C以下烘干。

   在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，然后置105°C的烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)。用坩堝將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時(shí)后，稱量--次，直到兩次稱量的數(shù)量不變，即達(dá)恒重。

 (二)消化

   取2個(gè)50毫升的凱氏燒瓶，向號(hào)燒瓶?jī)?nèi)加2毫升稀釋血清溶液(或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固體粉末)。注意，用吸量管直接將溶液(或用試管加入固體樣品)加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上，向2號(hào)燒瓶加入2毫升水作空白對(duì)照。

   在每個(gè)燒瓶?jī)?nèi)加入硫酸鉀一硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸3毫升，小瓷片兩粒,搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上,每個(gè)瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化。

   在消化開(kāi)始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開(kāi)始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢，待燒瓶?jī)?nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10 毫升(注意慢加，邊加邊搖)。冷卻后將瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)入50毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，后定容至刻度搖勻，做上記號(hào)備用。

(三)蒸餾

1、儀器的洗滌:儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。

蒸餾器(圖1-1)有幾種，應(yīng)用前需熟悉其使用方法。使用方法如下:

    開(kāi)放自來(lái)水，使水E進(jìn)入G，從K管流出(水不宜開(kāi)得過(guò)大以免水從G管溢出)。開(kāi)放P3，使水進(jìn)入A室，漏斗D中加蒸餾水約10毫升入B室。用拇指將管口按緊，同時(shí)開(kāi)放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸餾器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用。(可用PH試紙檢查。)

    A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開(kāi)關(guān)，P1為出水開(kāi)關(guān)，B為蒸餾室，與出氣室M相遇，M管插入盛有定量酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為指形冷凝管，E為進(jìn)水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時(shí)B室進(jìn)消化好的樣品及NaOH,二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，B室經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶中的酸吸收。

 2、滴定標(biāo)準(zhǔn)樣品

    先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液試驗(yàn)2-3 次。蒸餾器洗凈后，開(kāi)放水P3，使水進(jìn)入A室，水放至A室球部即可。

    取3個(gè)50毫升的錐形瓶，各準(zhǔn)確加入10毫升硼酸(內(nèi)加有混合指示劑)。用表面皿復(fù)蓋備用。

    加樣:用吸量管吸取1毫升標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，細(xì)心地由漏斗D傾入蒸餾室，再用蒸餾水1毫升清洗漏斗。取一個(gè)盛有硼酸一混合指示劑的錐形瓶，置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8毫升，隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。

    蒸餾:用酒精燈加熱(應(yīng)用擋風(fēng)板將燈圍攏，維持火力恒定，沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時(shí)起，繼續(xù)蒸餾5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開(kāi)液面再蒸2分鐘,后用蒸餾水洗導(dǎo)管外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。)

 3、樣品及空白蒸餾:用吸量管分別吸取1毫升樣品和1毫升蒸餾水按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾。

 4、滴定:蒸餾完畢，用0.0100N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定錐瓶?jī)?nèi)溶液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。

(四)計(jì)算

   式中: A為漓定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)； B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)； C為稱量樣品的克數(shù):0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度(實(shí)際上，此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫(xiě))； 14 為氮的原子量；6.25為常數(shù)(1毫升0.1N鹽酸相當(dāng)于0.14毫克氮)。
    若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定要更復(fù)雜一些。首先需向樣品中加入三lv乙酸，使其終濃度為5%，然后測(cè)定未加三lv乙酸的樣品及加入三lv乙酸后的樣品的上清液中的含氮量，從而計(jì)算出蛋白氨，再進(jìn)一步算出；蛋白質(zhì)的含量。
           蛋白氨=總氮-非蛋白氨
           蛋白質(zhì)含量(克%) =蛋白氮X6.25

五、注意事項(xiàng)

   1、凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織，器官及食品等成組復(fù)雜樣品的測(cè)定，只要細(xì)心操作都能得到的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果偏高。

   2、普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨，會(huì)影響結(jié)果，所以操作應(yīng)在單獨(dú)潔凈的房間中進(jìn)行，并盡可能快地對(duì)硼酸吸收液進(jìn)行滴定。

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

繪畫(huà)蒸餾裝置圖，計(jì)算待測(cè)樣品的總氮量和蛋白質(zhì)含量

七、思考題

1、正式測(cè)定未知樣品前為什么必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的含氮量及空白?

2、寫(xiě)出以下各步的化學(xué)反應(yīng)式:

①蛋白質(zhì)消化

②氨的蒸餾

?氨的滴定

3.指出本測(cè)定方法產(chǎn)生的誤差的原因。